七葉皂苷對(duì)洛伐他汀在高脂血癥大鼠模型體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響

吳秀君，苑冬敏，陳克研，馬 然，韓 波，于 艷

0 引言

他汀類藥物是一類強(qiáng)效的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能夠顯著降低總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平，是目前已知最有效的降脂藥物之一[1-2]。2016年國(guó)家心血管病中心發(fā)布的《中國(guó)成人血脂異常防治指南》明確了他汀類藥物作為血脂異常藥物治療的基石地位[3-4]。此外，他汀類藥物具有抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5-6]。盡管總體耐受性較好，但由于橫紋肌溶解以及肝腎功能損害等嚴(yán)重不良事件時(shí)有發(fā)生[7-8]，他汀類藥物的不良反應(yīng)仍應(yīng)引起足夠重視。研究顯示，他汀類藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率與藥物體內(nèi)暴露水平有關(guān)，隨著暴露水平的增加可呈幾何倍數(shù)增加[9-10]。他汀類藥物主要經(jīng)由藥物代謝酶CYP450代謝，CYP450的抑制或誘導(dǎo)可能改變他汀類藥物的代謝行為，導(dǎo)致藥物體內(nèi)暴露水平增加或降低，從而造成不良反應(yīng)增加或藥效降低[11-13]。

七葉皂苷是從七葉樹(shù)科植物天師栗的干燥種子中提取得到的一組三萜皂苷鹽，具有抗炎、抗?jié)B出、消腫、增加靜脈張力及改善微循環(huán)等藥理作用，臨床上主要用于慢性靜脈功能不全、腦水腫、創(chuàng)傷和手術(shù)后引起的腫脹的治療[14-15]。近年來(lái)，大量研究證實(shí)，七葉皂苷具有明顯的抗腫瘤作用，使得這一中藥有了更廣泛的應(yīng)用前景。除外用與口服劑型外，七葉皂苷主要通過(guò)靜脈滴注和靜脈注射給藥，在臨床上常與其他藥物配伍使用[16-17]。Huang等[18]研究顯示，七葉皂苷對(duì)大鼠肝CYP450有調(diào)控作用，能夠誘導(dǎo)CYP1A2的活性，但抑制CYP2C9和CYP3A4的活性。此外，七葉皂苷血漿蛋白結(jié)合率高，筆者前期研究顯示，七葉皂苷的血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)95%[19]，這些特征均提示，七葉皂苷具有與其他合并用藥發(fā)生相互作用的潛力。

本研究以洛伐他汀為模型藥物，觀察高脂血癥大鼠中七葉皂苷對(duì)洛伐他汀藥代動(dòng)力學(xué)行為的影響，旨在為他汀類藥物的臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 API 4000型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Applied Biosystem公司；TurboVap LV全自動(dòng)濃縮儀，美國(guó)Zymark公司；Milli-Q Gradient A10超純水器，美國(guó)Millipore公司；LX全自動(dòng)血液生化分析儀，美國(guó)Beckman公司；XS-225A電子分析天平，德國(guó)PRECISA公司。

1.2 藥品與試劑 洛伐他汀、洛伐他汀酸、辛伐他汀(內(nèi)標(biāo)，IS1)、辛伐他汀酸(內(nèi)標(biāo)，IS2)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，洛伐他汀膠囊(哈藥集團(tuán)制藥總廠)，注射用七葉皂苷鈉(武漢愛(ài)民制藥有限公司)，色譜純甲醇(美國(guó)Fisher公司)，其他試劑均為分析純。大鼠高脂飼料購(gòu)于江蘇協(xié)同生物。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(180±10.0) g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 動(dòng)物模型的建立 大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境[溫度(23±2) ℃，濕度(50%±10%)]中適應(yīng)1周后，隨機(jī)分組，6只給予普通飼料，另外12只給予高脂飼料，5周后經(jīng)眼眶靜脈采血測(cè)定三酰甘油(TG)、TC、LDC和高密度脂蛋白(HDL)。

2.1.2 分組與給藥 將造模成功的高脂血癥大鼠隨機(jī)分為2組，即單獨(dú)給藥組和聯(lián)合給藥組，每組6只大鼠。單獨(dú)給藥組大鼠尾靜脈注射給予0.9%生理鹽水，聯(lián)合給藥組大鼠尾靜脈注射給予注射用七葉皂苷鈉(0.5 mg/kg，以0.9%生理鹽水溶解)，1次/d，連續(xù)14 d。最后一次給藥后，兩組大鼠分別單劑量灌胃給予洛伐他汀(20 mg/kg，0.5%CMC-Na混懸液)，分別于洛伐他汀給藥前和給藥后0.5、1.0、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h于眼眶靜脈采血約0.3 ml，在2～8 ℃下5 000 r/min離心15 min，分離血漿，-70 ℃保存待測(cè)。

2.1.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定 血清生化指標(biāo)采用全血自動(dòng)生化分析儀測(cè)得。

2.1.4 血漿樣品中洛伐他汀和洛伐他汀酸濃度測(cè)定 色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Elipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-水(含10 mmol/L乙酸銨)(B)，梯度洗脫：0.0～1.3 min 80%～97%A，1.3～1.8 min 97% A，1.8～2.5 min 97%～80% A，2.5～3.7 min 80% A；流速為1.0 ml/min，1∶1分流；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI源)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；采用正負(fù)離子切換，洛伐他汀采用正離子檢測(cè)，電壓3 500 V，溫度 500 ℃。源內(nèi)氣體1 (GS1，N2)壓力：45 psi；源內(nèi)氣體2 (GS2，N2)壓力：35 psi。洛伐他汀酸采用負(fù)離子檢測(cè)，電壓-3 500 V，溫度500 ℃，GS1(N2)壓力：45 psi，GS2(N2)壓力：35 psi；洛伐他汀、洛伐他汀酸、辛伐他汀和辛伐他汀酸的解簇電壓(DP)分別為35、-55、50、-60 V，碰撞能量(CE)分別為35、-25、15、-25 eV，離子反應(yīng)分別為m/z427.1、m/z325.3(洛伐他汀，正離子)，m/z421.4、m/z319.2(洛伐他汀酸，負(fù)離子)和m/z441.3、m/z325.1(IS1，正離子)，辛伐他汀酸(IS2，負(fù)離子)m/z435.4、m/z319.2。前2.6 min為負(fù)離子檢測(cè)，后1.1 min為正離子檢測(cè)。

生物樣品預(yù)處理：精密吸取100 μl大鼠血漿，精密加入10 μl內(nèi)標(biāo)溶液(50 ng/ml)，渦旋混勻后加入環(huán)己烷-二氯甲烷(3∶1) 3 ml，渦旋混勻30 s，振蕩10 min后，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液，置另一干凈玻璃試管中，50 ℃水浴N2吹干，殘?jiān)?00 μl甲醇復(fù)溶后，12 000 r/min離心2 min，取上清10 μl進(jìn)樣分析。

2.2 結(jié)果

2.2.1 血清生化指標(biāo) 與食用普通飼料的大鼠相比，采用高脂飼料喂養(yǎng)5周后，SD大鼠血清TC、TG和LDL含量均顯著升高(P<0.01)，而HDL水平降低(P<0.05)，表明高脂血癥模型大鼠造模成功。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠血清生化測(cè)定結(jié)果(mmol/L)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 方法學(xué)驗(yàn)證 筆者對(duì)所建立的HPLC-MS/MS方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，洛伐他汀和洛伐他汀酸在0.1～50 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.998 8)，最低定量限均為0.1 ng/ml。在低、中、高3個(gè)質(zhì)控濃度水平(0.2、5、40 ng/ml)洛伐他汀和洛伐他汀酸的平均回收率(n=4)分別為80.2%～86.7%、78.5%～88.4%。洛伐他汀的日內(nèi)和日間精密度(RSD，n=6)分別為2.3%～8.2%、1.4%～6.5%，洛伐他汀酸的日內(nèi)和日間精密度(n=6)分別為1.1%～5.6%、2.5%～5.6%。洛伐他汀和洛伐他汀酸的準(zhǔn)確度(RE，n=6)分別為0.2%～6.2%、1.1%～6.1%。大鼠血漿中，洛伐他汀和洛伐他汀酸的基質(zhì)效應(yīng)分別為98.7%～112.1%、86.8%～95.7%。該方法靈敏度高、精密度好，可用于大鼠血漿中洛伐他汀及其活性代謝物洛伐他汀酸的含量測(cè)定。

2.2.3 藥代動(dòng)力學(xué)比較 大鼠口服洛伐他汀后，洛伐他汀和洛伐他汀酸的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在高脂血癥大鼠模型中，連續(xù)14 d給予七葉皂苷導(dǎo)致洛伐他汀代謝產(chǎn)物洛伐他汀酸的血漿暴露水平顯著升高，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞分別是單獨(dú)給藥組的2.43(90%CI：1.55，3.31)、2.66(90%CI：1.67，3.66)和2.99(90%CI：1.44，4.55)倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合給藥后，洛伐他汀酸的血漿清除率(Clz)下降(P<0.01)，但兩組消除半衰期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合給藥后洛伐他汀的體內(nèi)暴露水平也有所增加，但與單獨(dú)給藥組相比，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明七葉皂苷對(duì)洛伐他汀的體內(nèi)代謝沒(méi)有明顯影響。

3 討論

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，人群飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的重大變化以及人口老齡化的加劇，高脂血癥的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。2012年的調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)成人血脂異常總體患病率高達(dá)40.40%，更為嚴(yán)峻的是青少年兒童高脂血癥患病率也有明顯增加[2]。高脂血癥已然成為危害身心健康的重要危險(xiǎn)因素，對(duì)高脂血癥的防治已成為醫(yī)學(xué)界的一項(xiàng)重要課題，因此，尋求積極、有效的降脂治療方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，由于中醫(yī)藥的興起，中西醫(yī)結(jié)合治療正在成為降脂治療的新策略而被越來(lái)越多的用于臨床。然而，中西藥結(jié)合應(yīng)用也增加了不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這已在大量的文獻(xiàn)中得到證實(shí)。

圖1 高脂血癥大鼠灌胃給予洛伐他汀后洛伐他汀及洛伐他汀酸的血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 單獨(dú)給藥或與七葉皂苷聯(lián)合給藥后兩組大鼠洛伐他汀及其代謝物洛伐他汀酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6)

組別藥物AUC0-t(ng/ml·h)AUC0-∞(ng/ml·h)t1/2(h)Tmax(h)CLz[L/(h·kg)]Cmax(ng/ml)單獨(dú)給藥組洛伐他汀149.4±60.6185.5±86.410.4±8.14.1±3.81.6±0.812.2±7.9洛伐他汀酸133.2±48.1156.8±69.39.2±2.13.8±3.61.9±0.712.1±1.9聯(lián)合給藥組洛伐他汀181.7±98.2212.3±97.913.6±4.84.0±3.51.4±0.722.0±26.6洛伐他汀酸323.5±101.9*392.4±168.3*12.6±6.94.7±3.20.7±0.3**29.2±13.2*

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

洛伐他汀是第1代他汀類藥物，目前仍是臨床首選的調(diào)脂藥。其是一種內(nèi)酯形式的無(wú)活性前體藥物，在體內(nèi)62%轉(zhuǎn)化為開(kāi)放酸活性代謝物，即洛伐他汀酸，38%轉(zhuǎn)化為閉環(huán)內(nèi)酯代謝物。洛伐他汀酸是洛伐他汀的主要活性成分，其在體內(nèi)主要經(jīng)由CYP3A4/5代謝成無(wú)活性代謝產(chǎn)物而排出體外[13]。雖然洛伐他汀通常耐受性良好，但其具有肌病和橫紋肌溶解癥的嚴(yán)重不良反應(yīng)，且發(fā)生頻率不定。研究表明，在藥物的全身暴露較高時(shí)，發(fā)生這些嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。因此，在洛伐他汀的臨床應(yīng)用中，應(yīng)考慮可能影響藥物暴露的因素，包括年齡、性別、身高、體重、種族、疾病狀態(tài)以及合并用藥等，其中，與合并藥物的相互作用(DDI)是必須考慮的重要因素之一。有報(bào)道，在他汀類藥物不良反應(yīng)中，一半以上與DDI有關(guān)。由于洛伐他汀酸在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4/5酶代謝，因此，CYP3A4/5酶抑制劑或誘導(dǎo)劑具有與洛伐他汀發(fā)生DDI的潛力。近年來(lái)，中藥對(duì)CYP450酶的抑制誘導(dǎo)作用的報(bào)道越來(lái)越多，由此導(dǎo)致的DDI也屢見(jiàn)不鮮。七葉皂苷作為一種中藥提取物，其對(duì)CYP3A4和CYP2C9酶的抑制作用已經(jīng)得到證實(shí)[20]。七葉皂苷在臨床上常用于治療腦卒中所致的腦水腫，而他汀類藥物是腦卒中強(qiáng)化降脂治療的主要藥物，二者在聯(lián)合用藥時(shí)很有可能發(fā)生DDI。然而，迄今為止尚無(wú)七葉皂苷制劑與他汀類藥物相互作用的報(bào)道。本研究以洛伐他汀為模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，七葉皂苷降低了洛伐他汀在高脂血癥大鼠體內(nèi)的代謝，導(dǎo)致其主要代謝產(chǎn)物洛伐他汀酸的暴露水平顯著增加，而對(duì)前體藥物洛伐他汀本身的體內(nèi)暴露水平?jīng)]有顯著影響，推測(cè)七葉皂苷降低洛伐他汀酸代謝水平的機(jī)制可能與其對(duì)大鼠CYP3A4酶活性的抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)，七葉皂苷可抑制洛伐他汀在高脂血癥大鼠體內(nèi)的代謝，導(dǎo)致其暴露水平明顯增加，這種作用可能與七葉皂苷對(duì)藥物代謝酶CYP3A4的抑制有關(guān)。本研究結(jié)果提示，他汀類藥物在與七葉皂苷聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，應(yīng)根據(jù)臨床情況合理調(diào)整劑量，減少或避免由于相互作用所造成的不良反應(yīng)。