養(yǎng)胃顆粒中NF-κB靶標(biāo)介導(dǎo)的治療胃潰瘍成分的篩選與評(píng)價(jià)研究

呂玉玲，譚梅英，廖銀標(biāo)*

0 引言

胃潰瘍常采用口服藥物治療。其中，主要為H2受體拮抗劑或質(zhì)子泵抑制劑等，益生菌等調(diào)節(jié)菌群平衡的藥物可用于恢復(fù)胃部微生物平衡[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，發(fā)生腸胃等消化系統(tǒng)器官疾病時(shí)，部分與炎癥及能量代謝相關(guān)的靶標(biāo)可能發(fā)生異常表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胃黏膜細(xì)胞的再生、修復(fù)和凋亡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。中醫(yī)辨證則認(rèn)為，胃潰瘍系外邪入侵，脾胃虛寒等因素導(dǎo)致，可采用扶正驅(qū)邪、溫陽(yáng)解郁等方法，恢復(fù)相關(guān)臟器的機(jī)能與平衡[4-7]。因此，中藥治療脾胃疾病，主要采用黃芪、白術(shù)、三七、太子參等補(bǔ)氣活血、驅(qū)邪除寒功效的藥材進(jìn)行組方。

養(yǎng)胃顆粒由黃芪、三七、白術(shù)、太子參等多味藥材煎煮所得浸膏經(jīng)制粒所得，主要起養(yǎng)胃正氣、扶陽(yáng)驅(qū)邪之功效[8-9]。其中，黃芪為君藥，起養(yǎng)胃保肝、補(bǔ)氣活血的作用，能夠有效地保護(hù)胃黏膜，同時(shí)，可以通過(guò)激活FXR、Cdx2等相關(guān)靶標(biāo)，調(diào)控膽汁酸的外排，減輕胃腸道炎癥反應(yīng)[10-11]；三七、太子參為臣藥，所含活性成分多為皂苷類(lèi)，可以與黃芪中的活性成分起協(xié)同治療作用。目前，雖然方中多種藥味已有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的相關(guān)報(bào)道，但上述成分的量效關(guān)系如何，在配伍、組方之后，其作用機(jī)制是否出現(xiàn)變化，以及其中哪些成分起主要作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究基于復(fù)方藥物中的化學(xué)成分的靶標(biāo)激動(dòng)活性，評(píng)價(jià)上述成分在相關(guān)疾病治療中的作用及其程度。通過(guò)一系列分子生物學(xué)、藥物分析學(xué)和天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)已有文獻(xiàn)報(bào)道的養(yǎng)胃顆粒各藥味中的化學(xué)成分，如毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、白術(shù)內(nèi)酯I、車(chē)葉草苷等進(jìn)行靶標(biāo)親和活性評(píng)價(jià)，研究其對(duì)NF-κB靶標(biāo)的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)該制劑在胃潰瘍、慢性萎縮性胃病和胃黏膜損傷等疾病治療方面的作用。NF-κB廣泛分布于生物機(jī)體的各個(gè)臟器中，具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等功能，其激動(dòng)劑與拮抗劑可能是中藥治療胃潰瘍的主要成分[12-16]。因此，通過(guò)篩選養(yǎng)胃顆粒中已知化學(xué)成分進(jìn)行NF-κB親和活性篩選，并測(cè)定這些成分在成方制劑中的含量，可以為其后續(xù)開(kāi)發(fā)及機(jī)制研究提供寶貴經(jīng)驗(yàn)[17-20]。

1 儀器與材料

Thermo-TSQ高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo-Fisher，美國(guó))，配備Accela高壓泵和ESI離子源；Life Qubit蛋白熒光定量?jī)x(Qubit，美國(guó))；試劑盒；LC-MS分析、樣品處理、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用甲酸、乙腈購(gòu)自Merck(德國(guó))、甲醇、DMSO購(gòu)自Thermo-Fisher(美國(guó))；黃芪甲苷(批號(hào)：110316-200905)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)：070903-070324)、三七皂苷R1(批號(hào)：081305-201003)、人參皂苷Rb1(批號(hào)：110302-20120513)、人參皂苷Rb3(批號(hào)：050712-200908)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白術(shù)內(nèi)酯I(批號(hào)：R-004-1305)、車(chē)葉草苷(批號(hào)：R-0301-100)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司(中國(guó))；養(yǎng)胃顆粒由筆者所在單位制備，批號(hào)：20170201-20180503。

2 方法與結(jié)果

2.1 NF-κB激動(dòng)活性篩選 取RAW264.7細(xì)胞株，置于96孔板上，加NF-κB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，孵育，將所得細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，分為空白組、陽(yáng)性對(duì)照組和給藥組。除空白組外，各組加入0.5 μg/ml的LPS。給藥組分別給予毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、白術(shù)內(nèi)酯I、車(chē)葉草苷對(duì)照品溶液(12.5、25、50 μmol/L DMSO溶液)，每個(gè)化合物的每個(gè)濃度給予3孔，孵育。所得樣品進(jìn)行熒光測(cè)定，根據(jù)結(jié)果判斷各成分的NF-κB靶標(biāo)激動(dòng)活性。按以下公式計(jì)算各化合物對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的抑制率：抑制率%=[1-(CS-A0)/(Cm-C0)]×100。Cm為模型組熒光值，即LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性上調(diào)水平；C0為空白對(duì)照組熒光值，即NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的基礎(chǔ)水平；Cs為L(zhǎng)PS 與受試藥物共刺激細(xì)胞時(shí)的熒光值，即受試藥物對(duì)NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制水平。所得結(jié)果代入Graph Prism5.0軟件分析，結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的NF-κB靶標(biāo)激動(dòng)活性較強(qiáng)，可以作為后續(xù)基于功效主治的指標(biāo)成分。見(jiàn)表1、圖1。

表1 養(yǎng)胃顆粒各成分NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制率測(cè)定結(jié)果(n=3)

圖1 各成分NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制率測(cè)定結(jié)果

2.2 含量測(cè)定供試品的制備 取養(yǎng)胃顆粒約0.5 g，精密稱(chēng)定，加甲醇50 ml，精密稱(chēng)定重量，超聲30 min，取出，放冷后以甲醇補(bǔ)足重量；精密吸取所得溶液100 μl，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3 含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1對(duì)照品適量，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；精密吸取所得溶液100 μl，置于另一10 ml量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得2種對(duì)照品含量均為1 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.4 LC-MS條件 采用ESI離子源，正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，噴霧電壓3 500 V，霧化溫度350 ℃，鞘氣壓力30 psi，輔氣壓力10 psi；離子對(duì)為毛蕊異黃酮葡萄糖苷786/425(正離子，碰撞電壓23 V)，三七皂苷R1為945/925(負(fù)離子，碰撞電壓17 V)。液相色譜部分，色譜柱為Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，使用0.1%甲酸(A)-乙腈(B)作為流動(dòng)相，梯度洗脫，程序?yàn)椋?～0.2 min，10% B，0.2～0.7 min，10%～90%B，0.7～1.7 min，90%B，1.7～2.0 min，90%～10%B。測(cè)定所得對(duì)照品和供試品離子圖見(jiàn)圖2。

圖2 養(yǎng)胃顆粒供試品(A)和對(duì)照品(B)(A、B濃度均為0.1 μg/ml)溶液離子流圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性 精密吸取對(duì)照品溶液適量，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，分別配制不同濃度的6份樣品，濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/ml。吸取上述溶液，分別按“2.4”項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，記錄總離子流圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，代入Excel中進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為Y=1 669 715.206 6 X-6 671.214 0(毛蕊異黃酮葡萄糖苷，r2=0.999 3)和Y=661 286 X+151.87(三七皂苷R1，r2=0.999 1)，表明方法線(xiàn)性良好，能夠在0.01～1.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，記錄總離子流圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為2.23%，三七皂苷R1峰面積的RSD為0.47%，表明方法精密度良好。

2.5.3 回收率試驗(yàn) 取養(yǎng)胃顆粒約0.25 g，精密稱(chēng)定，置50 ml錐形瓶中，共稱(chēng)定3份；每份樣品按表2、表3所述最終濃度加入適量對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定3次。記錄總離子流圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面積，計(jì)算二者含量、回收率和RSD。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為100.86%，RSD為3.02%；三七皂苷R1的平均回收率為99.92%，RSD為2.82%。表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別在0、2、4、6、12、24 h按“2.4” 項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，記錄總離子流圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面積，計(jì)算二者含量和RSD。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的RSD為1.77%，三七皂苷R1的RSD為0.88%，表明方法所制備樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品測(cè)定 取養(yǎng)胃顆粒10批，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4” 項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，記錄總離子流圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1的峰面積，計(jì)算二者含量和RSD。結(jié)果顯示，10批養(yǎng)胃顆粒中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為0.834 mg/g，RSD為19.42%；三七皂苷R1的平均含量為0.512 mg/g，RSD為36.37%。見(jiàn)表4。

3 討論

養(yǎng)胃顆粒以黃芪為君藥，劉小花等[9]的研究表明，黃芪對(duì)胃潰瘍和胃黏膜損傷具有較好的治療作用，譜效學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有較高的貢獻(xiàn)度。因此，結(jié)合“2.1”項(xiàng)下機(jī)理研究結(jié)果，可以將毛蕊異黃酮葡萄糖苷列為養(yǎng)胃顆粒治療胃潰瘍的活性成分之一。有報(bào)道，三七聯(lián)合黃芪使用時(shí)，胃潰瘍的治愈率可顯著提高。黃芪具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿的功效；三七則具有散瘀止血、消腫定痛的功效。兩種藥味在養(yǎng)胃顆粒治療胃潰瘍中起主要作用，靶標(biāo)親和活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和LC-MS含量測(cè)定結(jié)果充分驗(yàn)證了該制劑組方與辨證的合理性。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷回收率測(cè)定結(jié)果

表3 三七皂苷R1回收率測(cè)定結(jié)果

表4 十批養(yǎng)胃顆粒測(cè)定結(jié)果(mg/g)

含量測(cè)定方法選擇方面，LC-MS采用特征離子對(duì)分析的檢測(cè)方法，很大程度上免除了傳統(tǒng)液相色譜對(duì)各成分進(jìn)行分離和指認(rèn)的繁瑣過(guò)程，分析效率提高，更為適宜基于功效主治的中藥多指標(biāo)含量測(cè)定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本研究結(jié)果表明，制備的不同批次樣品中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和三七皂苷R1含量差異較大，這可能是由于制備養(yǎng)胃顆粒所用藥材批次不同，目標(biāo)成分含量差異較大引起。上述結(jié)果表明，在選擇制備所用藥材時(shí)，應(yīng)以目標(biāo)成分為指標(biāo)對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，再根據(jù)本研究所得量效關(guān)系結(jié)果，判斷是否采用該批次藥材進(jìn)行投料生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究基于中醫(yī)藥經(jīng)典理論，通過(guò)細(xì)胞水平NF-κB靶標(biāo)親和活性成分篩選，基本明確了養(yǎng)胃顆粒中治療胃潰瘍的活性成分，并以此為指標(biāo)建立了對(duì)該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。該方法快速、準(zhǔn)確、高效，為基于功效主治的中藥作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了科學(xué)依據(jù)。