艾灸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠海馬與結(jié)腸組織中IKKβ/IKBα/NF-κB通路的影響

王 宇，陳 霞，吳立斌，仝 理，李 難，儲(chǔ)浩然，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸臨床研究所，安徽 合肥 230012)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適為主，伴有排便習(xí)慣改變和(或)大便性狀異常，而缺乏胃腸道結(jié)構(gòu)和生化異常的腸道功能紊亂性疾病。臨床以腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)最為多見，癥狀以腹痛伴排便次數(shù)增多，大便性狀稀溏、或帶有黏液、甚至水樣便為主，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前IBS常用的治療方法有解痙劑、止瀉藥、腸道動(dòng)力調(diào)節(jié)藥、微生態(tài)制劑、抗焦慮藥物、飲食等，療效并不滿意，且癥狀易反復(fù)發(fā)作[2-6]。針灸對(duì)功能性胃腸疾病的防治具有良好的療效，且不良反應(yīng)少[7]。

IBS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其發(fā)病機(jī)制可能與腦-腸軸相互作用、炎癥與免疫異常、腸道動(dòng)力改變、食物、精神心理障礙等有關(guān)[8-10]，其中腦-腸軸相互作用和腸道黏膜低度炎癥在IBS的發(fā)展中起著重要作用[11-14]。核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa B， IκB)激酶β(IκB kinase beta，IKKβ)/核因子κB抑制蛋白α(NF-kappa-B inhibitor alpha， IKBα)/核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路被認(rèn)為與IBS炎癥反應(yīng)表現(xiàn)密切相關(guān)[15]，其關(guān)鍵是NF-κB分子從胞質(zhì)向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。

近年來，艾灸改善腸道黏膜低度炎癥的作用機(jī)制是研究的熱點(diǎn)，且IBS-D的炎癥反應(yīng)與腦-腸軸密切相關(guān)。目前，大多數(shù)艾灸治療IBS的機(jī)制研究是觀察個(gè)別炎癥因子或炎癥通路，對(duì)腦-腸軸機(jī)制研究較少，且缺乏將腦-腸軸與炎癥通路相聯(lián)系來分析艾灸抗炎的作用機(jī)制。本研究擬觀察艾灸對(duì)IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)的影響，探討艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量為200～250 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2017-0001]。動(dòng)物在安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為Ⅱ級(jí)，光照周期12 h/12 h，室溫為22～25 ℃，相對(duì)濕度為45%～60%，自由進(jìn)食、飲水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)動(dòng)物的處置遵循中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試藥及儀器 直徑0.5 cm細(xì)艾條(批號(hào) 2018-10-06)：南陽宛北艾絨廠；IKKβ抗體(批號(hào) AF03043503)：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IKBα抗體(批號(hào) GR275907-37)：英國 Abcam；NF-κB 抗體(批號(hào) 9)：美國CST；ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號(hào) SF249607)：美國Thermo；番瀉葉購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥制劑室提供制劑。

電泳儀(型號(hào) EPS300)、轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào) VE-186)：上海天能科技有限公司；微量移液器(型號(hào) P10)：德國Eppendorf；自動(dòng)曝光儀(型號(hào)JS-1070P)：上海培清科技有限公司；全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)Pannoramic MIDI：匈牙利3DHISTECH。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與分組 采用慢性束縛聯(lián)合番瀉葉灌胃方法復(fù)制IBS-D模型。24只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、艾灸組，每組8只。將番瀉葉置入100 ℃沸水中浸泡30 min，并經(jīng)雙層紗布過濾，最后將濾液減壓濃縮成生藥含量為0.45 g/mL，在-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩３瞻捉M外，其余兩組大鼠進(jìn)行番瀉葉灌胃(0.45 g/mL，10 mL/kg)，灌胃后，用粗制棉繩束縛大鼠雙后肢，限制其活動(dòng)，放入飼養(yǎng)箱中，每日1 h?？瞻捉M大鼠僅予等容積蒸餾水灌胃，連續(xù)14 d。在模型復(fù)制結(jié)束后第1天，觀察大鼠大便情況、直腸擴(kuò)張(colorectal distension，CRD)和腹部回縮反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)。若模型組和艾灸組大鼠稀便率升高至少50%、AWR的最小容量閾值降低至少1 mL，且與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則表明模型復(fù)制成功。

2.2 治療方法 模型復(fù)制成功后，艾灸組大鼠取雙側(cè)“上巨虛”“天樞”[16]。將艾灸組大鼠置于特制大鼠艾灸架上，將直徑0.5 cm的細(xì)艾條固定于艾灸支架上，懸于穴位上空約2 cm，每日1次，每次每穴灸30 min，共7次。空白組和模型組不做任何處理。

2.3 觀察指標(biāo)和方法

2.3.1 稀便率的計(jì)算 在治療結(jié)束后第1天，觀察6 h內(nèi)各組大鼠的稀便率。稀便率=稀便數(shù)/總排便粒數(shù)×100%。干便、稀便的區(qū)分以濾紙上有無污跡為標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 內(nèi)臟敏感性評(píng)估(CRD所引起AWR的最小容量閾值測(cè)定) 稀便率檢測(cè)結(jié)束后，對(duì)各組大鼠CRD誘發(fā)刺激下的AWR進(jìn)行容量閾值測(cè)定。測(cè)定前，各組大鼠禁食不禁水12 h。對(duì)大鼠進(jìn)行輕度麻醉后，甘油潤滑8F的導(dǎo)尿管，將導(dǎo)尿管緩慢插入肛門，將大鼠置于透明塑料盒中，待大鼠完全蘇醒后約20 min，經(jīng)球囊注入26～28 ℃的生理鹽水，觀察引起大鼠AWR的最小容量閾值，重復(fù)3次，取3次均值作為該大鼠CRD引起AWR的最小容量閾值。

2.3.3 Western-blot法檢測(cè)大鼠海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表達(dá) 各組大鼠結(jié)腸組織采用勻漿方法提取其中蛋白，經(jīng)過電泳，在轉(zhuǎn)膜裝置恒流轉(zhuǎn)膜，IKKβ轉(zhuǎn)膜85 min；IKBα轉(zhuǎn)膜35 min；NF-κB(p65)轉(zhuǎn)膜65 min。加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉2 h。按照合適的比例用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋(IKKβ抗體屬性為兔抗1∶300稀釋；IKBα抗體屬性為兔抗1∶10 000稀釋；NF-κB(p65)抗體屬性為兔抗1∶1 000稀釋)，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。按照1∶20 000用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，最后用ECL發(fā)光試劑蛋白檢測(cè)。用自動(dòng)曝光機(jī)曝光顯影，用 Image J軟件進(jìn)行膠片條帶的分析，以β-actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白與β-actin的比值為其相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠AWR的最小容量閾值和稀便率比較 與空白組比較，模型組大鼠AWR的最小容量閾值顯著下降(P<0.05)，稀便率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠AWR的最小容量閾值顯著升高(P<0.05)，稀便率顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠AWR的最小容量閾值和稀便率比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠海馬和結(jié)腸中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬和結(jié)腸中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠海馬和結(jié)腸中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠海馬和結(jié)腸中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.空白組；B.模型組；C.艾灸組

圖1 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白電泳圖

4 討論

IBS是現(xiàn)代社會(huì)常見的腸病之一，其中又以IBS-D多見，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，腸道黏膜低度炎癥、腦-腸軸相互作用可能起到至關(guān)重要的作用。隨著對(duì)NF-κB結(jié)構(gòu)與功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活是腸道炎癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NF-κB信號(hào)通路中3個(gè)關(guān)鍵因子依次為IKKβ、IKBα和NF-κB[17]。NF-κB通常指P50/P65(ReLA)的二聚體。當(dāng)細(xì)胞接受外界刺激后，可激活I(lǐng)KKβ，IKKβ催化IKBα的N-末端絲氨酸磷酸化，導(dǎo)致IKBα泛素化并降解，則NF-κB游離，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，核內(nèi)的NF-κB增多，啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)和下游通路[15]。本研究發(fā)現(xiàn)IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平升高，艾灸治療后，IBS-D大鼠稀便率降低、AWR的最小容量閾值升高，海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平降低，提示艾灸通過抑制IKKβ/IKBα/NF-κB信號(hào)通路的作用改善炎癥反應(yīng)。

腦-腸軸是指胃腸道和大腦間相互作用的雙向調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其有機(jī)地把胃腸功能和腦功能聯(lián)系起來，是維持腸道正常生理功能的基礎(chǔ)，腸道疾病的治療可通過腦-腸軸起作用[18-19]。腸道黏膜損傷或發(fā)生炎癥后，可引起多種化學(xué)遞質(zhì)的釋放，支配胃腸道的內(nèi)臟初級(jí)傳入神經(jīng)纖維自發(fā)活動(dòng)增強(qiáng)，使中樞從外周獲得的傷害感受增加，同時(shí)表現(xiàn)為感覺閾值降低。腦的各級(jí)中樞接受內(nèi)外環(huán)境變化時(shí)傳入的各種信息，經(jīng)過整合，將其調(diào)控信息傳送到腸神經(jīng)系統(tǒng)或直接作用于胃腸效應(yīng)細(xì)胞[19-20]。功能磁共振成像顯示IBS患者存在腦部功能的變化，大腦皮質(zhì)的活動(dòng)性與內(nèi)臟感覺以及癥狀呈現(xiàn)同步改變的現(xiàn)象，且目前IBS患者中，海馬功能的紊亂已是很多研究達(dá)成的共識(shí)[21]。在進(jìn)行CRD時(shí)，IBS患者額前皮質(zhì)、右腦島皮質(zhì)、右側(cè)丘腦的激活面積和磁共振信號(hào)強(qiáng)度變化顯著增大[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平明顯升高。艾灸治療后，IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示艾灸通過抑制海馬與結(jié)腸組織IKKβ/IKBα/NF-κB信號(hào)通路改善炎癥反應(yīng)，且艾灸治療IBS-D可能是通過腦-腸軸途徑實(shí)現(xiàn)的。

根據(jù)IBS-D的主要臨床表現(xiàn)，其可歸屬為“泄瀉”“腹痛”范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病多因?yàn)橄忍旆A賦不足和(或)后天失養(yǎng)、情志失調(diào)、飲食不節(jié)、感受外邪等而發(fā)，其病位在腸，涉及肝脾胃等臟腑。艾灸具有溫陽通脈、活血化瘀、舒經(jīng)活絡(luò)之功效。天樞穴乃大腸募穴，是升清降濁之樞紐，能調(diào)節(jié)人體氣機(jī)的升降，起到利濕止瀉的功效。上巨虛作為大腸下合穴，對(duì)六腑疾病有特殊治療作用，《針灸甲乙經(jīng)》記載“飧泄大腸痛，巨虛上廉主之”，多用于治療腸腑病證。上巨虛與天樞合募配伍，補(bǔ)益脾氣，通降腸腑氣機(jī)，升清降濁，止瀉止痛。

綜上，艾灸“天樞”“上巨虛”改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀和內(nèi)臟高敏感性，可能與艾灸抑制IKKβ/IKBα/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，且可能是通過腦-腸軸起作用的，但具體作用機(jī)制尚未明確，還需進(jìn)一步研究。