HPLC法測(cè)定原料藥AL58805中基因毒雜質(zhì)

朱小華 呂列超 趙金亮 劉巧云 夏 玥 張 迪

(1.常州佳德醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 常州 213164；2.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 常州 213164)

AL58805[1]是1類分子靶向抗腫瘤創(chuàng)新藥物，已獲得了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的臨床試驗(yàn)批件(批件號(hào)2017L15180 和2017L05181)，目前已進(jìn)入臨床研究[2]。AL58805進(jìn)入人體后，會(huì)選擇特定的致癌位點(diǎn)來發(fā)揮作用，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性死亡，而不會(huì)波及周圍的正常組織細(xì)胞。通過抑制腫瘤信號(hào)通路，對(duì)特定腫瘤有顯著的治療作用，為癌癥患者帶來了新的希望[3]。由于AL58805為對(duì)甲苯磺酸鹽，在合成中使用了有機(jī)溶劑甲醇和乙醇，有可能會(huì)反應(yīng)生成潛在基因毒雜質(zhì)對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯[4]，因此建立對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯的測(cè)定方法很有必要。

目前，對(duì)甲苯磺酸酯類的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6-8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]等。高效液相色譜法具有低成本、分離效率快、靈敏度高、適用于熱不穩(wěn)定化合物等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立了HPLC法測(cè)定AL58805原料藥中對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯含量的方法，可為該藥有害雜質(zhì)的檢測(cè)提供參考。

AL58805制劑臨床服藥劑量約為150 mg·d-1，根據(jù)EMA《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》規(guī)定的限度，每人不能超過1.5 μg·d-1，則得到AL58805原料藥中對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)限度均為10 ppm[11]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器。

1.2 試劑

AL58805原料藥(常州佳德醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20150501、20150601、20150701)；MPTS(對(duì)甲苯磺酸甲酯，阿拉丁，含量98.0%，批號(hào)E1528080)；EPTS(對(duì)甲苯磺酸乙酯，阿拉丁，含量98.0%，批號(hào)H1524007)；乙腈(色譜純)；磷酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；水。

2 方法

2.1 色譜條件

InertSustain C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.015 mol·L-1磷酸水溶液-乙腈(50∶50，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；洗脫時(shí)間為18 min；溶劑為乙腈-水(50∶50，V/V)。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取MPTS對(duì)照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為對(duì)MPTS貯備液。另精密稱取EPTS對(duì)照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為EPTS貯備液。分別精密量取MPTS、EPTS貯備液適量，加溶劑稀釋制成每1 mL中約含MPTS、EPTS各10 μg的混合溶液作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液適量，加溶劑稀釋制成每1 mL中約含MPTS、EPTS各100ng的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

取AL58805原料藥約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量溶劑溶解后，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，超聲10 min，于0℃析晶30 min后，取出強(qiáng)力振搖，靜置60 min后，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 波長(zhǎng)選擇

精密量取對(duì)照品貯備液20 μL注入液相色譜儀，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行PDA掃描。結(jié)果顯示，MPTS和EPTS在225nm處有最大吸收，因此選擇225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 專屬性試驗(yàn)

對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，AL58805、MPTS、EPTS完全分離，保留時(shí)間分別為6.340、10.733、14.038 min，空白溶液對(duì)MPTS、EPTS的測(cè)定無干擾，說明本色譜條件專屬性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取新鮮制備的對(duì)照品溶液20 μL，分別于0、3、7、10、17、24 h 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，MPTS、EPTS的RSD 分別為3.8%、3.7%。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 定量限和檢測(cè)限

分別精密量取MPTS、EPTS貯備液適量，采用逐步稀釋法，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄信噪比(S/N)約為10和3時(shí)的色譜圖。測(cè)得MPTS、EPTS的定量限(S/N≈10)分別為9.960、13.64 ng·mL-1，檢測(cè)限(S/N≈3)分別為3.320、4.550 ng·mL-1。

3.5 線性范圍

精密量取MPTS貯備液適量，加溶劑稀釋制成濃度分別為3.320、30、60、100、150、200 ng·mL-1的線性系列溶液；另精密量取EPTS貯備液適量，加溶劑稀釋制成濃度分別為4.550、30、60、100、150、200 ng·mL-1的線性系列溶液；分別精密量取 20 μL注入液相色譜儀，記錄MPTS、EPTS的峰面積。以濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸。求得回歸方程分別為MPTS:Y=0.0638X+0.0029，R2=0.9997；EPTS:Y=0.0623X+0.0456，R2=0.9992。線性范圍分別為EPTS:3.320～200 ng·mL-1；MPTS:4.550～200 ng·mL-1。

3.6 精密度試驗(yàn)

3.6.1重復(fù)性

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.10 mL，置10 mL量瓶中，共量取6份，加入已知MPTS、EPTS含量的待測(cè)原料藥AL58805約100 mg，加適量溶劑溶解，按“2.2.2”項(xiàng)下處理，取續(xù)濾液作為重復(fù)性試驗(yàn)溶液。分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄MPTS、EPTS的峰面積。結(jié)果表明，MPTS、EPTS的回收率分別為105.8%、99.0%，RSD分別為1.2%、2.3%。

3.6.2中間精密度

更換儀器和日期，按“3.6.1”項(xiàng)下重新配制6份試樣溶液進(jìn)行檢測(cè)。中間精密度與重復(fù)性試驗(yàn)12次結(jié)果表明，MPTS、EPTS的回收率分別為106.5%、92.5%，RSD分別為1.2%、7.6%。結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度。

3.7 加樣回收率

分別取已知MPTS、EPTS含量的原料藥AL58805約100 mg，置10 mL量瓶中，依次加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.07，0.10，0.13 mL各3份，加適量溶劑溶解，按“2.2.2”項(xiàng)下處理，制成低、中、高濃度的回收率溶液。精密量取各回收率試驗(yàn)溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄MPTS、EPTS的峰面積。計(jì)算MPTS、EPTS在供試品中的回收率分別為92.1% 、101.4%，RSD均為2.8%。結(jié)果見表1、表2。

3.8 耐用性試驗(yàn)

采用了“2.1”項(xiàng)下的方法，適量調(diào)整了色譜條件參數(shù)(柱溫、流速、色譜柱品牌)，精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，本法具有良好的耐用性。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(MPTS，n=9)

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(EPTS，n=9)

3.9 樣品含量測(cè)定

取AL58805原料藥，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算AL58805原料藥中MPTS、EPTS的含量。結(jié)果顯示，三批供試品中均未檢出MPTS、EPTS，圖譜見圖1。

A：對(duì)照品溶液，B：供試品溶液圖1 典型色譜圖Fig. 1 TypicalChromatograms

4 討論

由于本方法中供試品濃度較高，故增加了樣品前處理步驟(溶解、析晶、過濾等)，從而大大降低了進(jìn)樣溶液中供試品濃度，減少高濃度樣品溶液對(duì)雜質(zhì)測(cè)定的干擾。

綜上所述，本文建立的采用HPLC法測(cè)定原料藥AL58805中基因毒雜質(zhì)對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯，方法具有成本低廉、靈敏度高，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可以為原料藥AL58805的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。