抵當(dāng)陷胸湯對糖尿病大鼠肝臟TGF-β1/Smad3信號通路的影響

蔡正銀，儲全根，軒 云，儲 俊，王 盼

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230038)

糖尿病肝損傷是糖尿病導(dǎo)致的病變之一，其病理改變包括炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)蓄積和肝臟纖維化等[1]，其中肝纖維化是該并發(fā)癥的主要病變。高血糖導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制與糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的形成及所誘導(dǎo)的一系列級聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、相關(guān)細(xì)胞因子的作用、肝星狀細(xì)胞的激活等均相關(guān)[2]。有實(shí)驗(yàn)[3]證明，在糖尿病模型大鼠病程8周時(shí)出現(xiàn)早期纖維化病理學(xué)的改變。TGF-β1信號傳導(dǎo)通路激活在糖尿病肝損傷病變中具有重要作用。筆者認(rèn)為，AGEs的形成、肝纖維化等病理變化與中醫(yī)學(xué)“痰瘀阻絡(luò)”病機(jī)相符，因而將具有“化瘀通絡(luò)”作用的抵當(dāng)湯與具有“化痰”作用的小陷胸湯合方(簡稱抵當(dāng)陷胸湯)，以TGF-β1/Smad3信號通路相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)水平等作為觀察指標(biāo)，并以AGEs及其交聯(lián)特異性蛋白抑制劑阿拉氯胺(alagebrium chloride-711，ALT-711)作為對照[4]，探討抵當(dāng)陷胸湯調(diào)控TGF-β1/Smad3信號通路的傳導(dǎo)，從而干預(yù)糖尿病肝臟纖維化病變的部分機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 選取健康雄性清潔級SD大鼠34只，體質(zhì)量為(220±20)g、鼠齡為12周，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK-(皖)2017-0001。實(shí)驗(yàn)獲安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批文號為AHUCM-rats-2019014。

1.2 藥物 抵當(dāng)陷胸湯：全瓜蔞30 g，桃仁15 g，水蛭、虻蟲、制大黃、清半夏各10 g，黃連5 g；由安徽中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部提供，煎煮濃縮制備成凍干粉。ALT-711，每支50 mg，MedChemExpress USA公司，批號 HY-106024B。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(S17049)：Sigma公司；Revert AidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(00691399)：Thermo Scientific；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(0512841)：Novoprotein；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(137699，136080)：Zs-BIO。

1.4 儀器 高速臺式冷凍離心機(jī)(JW-3021HR)：安徽嘉文；水平搖床(TS-1000)：海門市其林貝爾；自動曝光儀(JS-1070P)：上海培清；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)：Thermo Scientific。

2 方法

2.1 動物分組、模型建立和干預(yù)方法 將34只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分成空白組10只，其余24只大鼠按55 mg/kg劑量腹腔注入STZ溶液，72 h后，尾靜脈法測空腹血糖>16.7 mmol/L者即糖尿病模型復(fù)制成功[5]。將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、抵當(dāng)陷胸湯組和ALT-711組，每組8只。按人鼠體質(zhì)量換算系數(shù)[6]換算后，空白組和模型組按等容積蒸餾水灌胃2 mL；抵當(dāng)陷胸湯組按每日8.10 g/kg劑量灌胃抵當(dāng)陷胸湯藥液；ALT-711組按每日3 mg/kg劑量灌胃。第8周末用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)溶液腹腔注射麻醉狀態(tài)下取材。

2.2 Western blot法檢測TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表達(dá)水平 每組取肝臟組織100 mg，加入細(xì)胞裂解液1 mL，離心后取上清液測總蛋白濃度；經(jīng)10% SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，將分離蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；根據(jù)一抗的說明書,TGF-β1、Smad3和p-Smad3抗體屬性為兔抗1∶1 000稀釋，4 ℃過夜，取出PVDF膜，加PBST洗滌液洗3次；根據(jù)二抗的說明書，按照1∶10 000用二抗稀釋液稀釋，室溫孵育2 h；使用ECL發(fā)光試劑盒檢測TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表達(dá)水平。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TGF-β1和Smad3 mRNA表達(dá)水平 每組取肝臟組織100 mg，液氮研磨成粉末，裂解冰浴后，提取RNA并測量其濃度和純度；每組取質(zhì)量為1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，其余樣品-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。按照熒光定量PCR說明書，以β-actin為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物序列。β-actin：上游CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增片段長度為150 bp；TGF-β1：上游5′- AGGTCCTTGCCCTCTACAAC-3′，下游5′-CGTAGTAGACGATGGGCAGT-3′，擴(kuò)增片段長度為96 bp；Smad3：上游5′- GAGTGGAGAGCAGGGACTTT-3′，下游5′- ACACACTCTCAGGTCAGTGG-3′，擴(kuò)增片段長度為74 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度95 ℃，時(shí)間1 min；變性溫度為95 ℃，時(shí)間20 s，退火溫度為60 ℃，時(shí)間60 s，40個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；抵當(dāng)陷胸湯組和ALT-711組大鼠TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)水平較模型組均明顯下調(diào)(P<0.05)，抵當(dāng)陷胸湯組和ALT-711組TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明其效果相當(dāng)。見圖1、圖2。

注：A.空白組；B.模型組；C.抵當(dāng)陷胸湯組；D.ALT-711組

注：A.空白組；B.模型組；C.抵當(dāng)陷胸湯組；D.ALT-711組； 與空白組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠肝臟組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；抵當(dāng)陷胸湯組和ALT-711組大鼠肝臟組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)水平較模型組均明顯下調(diào)(P<0.05)；抵當(dāng)陷胸湯組和ALT-711組TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明其效果相當(dāng)。見圖3。

注：A.空白組；B.模型組；C.抵當(dāng)陷胸湯組；D.ALT-711組；與空白組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

4 討論

目前的研究表明，TGF-β1是與肝臟纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子。糖尿病患者長期在高血糖環(huán)境下，AGEs過度蓄積，在肝臟組織引起氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，從而損傷肝細(xì)胞。肝臟受損傷時(shí)會分泌大量的TGF-β1，TGF-β1通過激活下游Smad3途徑信號蛋白，作為共同遞質(zhì)和磷酸化的受體Smad3相結(jié)合形成低聚體復(fù)合物后在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[7]，實(shí)現(xiàn)對靶基因的調(diào)控，同時(shí)使肝星狀細(xì)胞活化、增殖、轉(zhuǎn)型并分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，ECM過度累積導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。因此TGF-β1在纖維化起始和持續(xù)發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是肝臟纖維化的潛在治療靶標(biāo)。

中醫(yī)理論認(rèn)為，作為代謝產(chǎn)物的AGEs具有“痰”的特點(diǎn)，而纖維化病變具有“絡(luò)脈瘀阻”的特征，因此，可將AGEs蓄積及所導(dǎo)致的相關(guān)病變歸之為痰瘀互結(jié)，采用痰瘀同治法。抵當(dāng)陷胸湯具有“搜剔絡(luò)道痰瘀同治”之功，小陷胸湯化痰，抵當(dāng)湯化瘀通絡(luò)，清除阻滯于絡(luò)脈之病理廢物，改善局部氣血運(yùn)行。抵當(dāng)湯中水蛭咸苦平，虻蟲苦而微寒，二藥均有破血逐瘀通絡(luò)之功；桃仁苦平，可活血祛瘀；大黃苦寒，既能瀉熱，也有化瘀作用；四藥配伍，具有“搜絡(luò)化瘀”功效。小陷胸湯中瓜蔞甘寒，可寬胸化痰；半夏辛溫，化痰散結(jié)；黃連苦寒，瀉熱解毒；三藥同用，可起“化痰清熱”之效。綜合以上藥物，本方總體藥性偏寒，既著眼局部病變，又兼顧糖尿病內(nèi)熱之基本病機(jī)。

課題組前期采用化瘀通絡(luò)治法干預(yù)糖尿病心肌病變，已取得較好效果[8-9]。方朝暉亦認(rèn)為運(yùn)用活血化瘀是治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要治則[10]。鑒于糖尿病肝損傷的纖維化病變與糖尿病心肌病變具有共同的病理改變，所以在前述研究基礎(chǔ)上將化痰化瘀通絡(luò)之法拓展到干預(yù)糖尿病肝臟病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組的糖尿病大鼠TGF-β1/Smad3通路的相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)，而采用痰瘀同治的抵當(dāng)陷胸湯后，TGF-β1/Smad3通路的相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，與ALT-711組治療效果相當(dāng)，表明上述治法對糖尿病肝臟并發(fā)癥肝臟組織TGF-β1/Smad3信號傳導(dǎo)有抑制作用，與其他研究者[11-13]研究結(jié)果一致，因此可以認(rèn)為，具有痰瘀同治的抵當(dāng)陷胸湯可以通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路激活，從而對糖尿病大鼠的肝纖維化病變具有干預(yù)作用。