電針聯(lián)合豐富康復訓練對局灶性腦缺血大鼠PI3K/AKT信號通路的影響

豐麗媛，唐 巍，蘭 葳，閆鳴鳴，何 鵬，童明月

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012；3.亳州市中醫(yī)院，安徽 亳州 236800)

腦卒中可歸屬于中醫(yī)“中風”范疇，是一種常見的心腦血管病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點。中國是全球腦卒中發(fā)病率較高的國家之一，患病率逐年持續(xù)增加，且腦卒中患者年輕化趨勢明顯。缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病率的60%～80%[1]，是由多種因素引起的腦組織局部供血減少或完全中斷，導致腦組織缺血缺氧的一種腦血液循環(huán)障礙性疾病，臨床伴有不同程度神經功能缺損的表現[2]，如偏癱、語言障礙、認知障礙。目前有研究[3]表明，缺血性腦卒中后內源性血管新生在改善腦組織功能中有重要作用，其新生成的血管可以增加缺血區(qū)腦組織的氧供和營養(yǎng)物質，挽救瀕危組織。故血管新生是治療缺血性腦卒中的潛在靶點，刺激血管新生可以作為治療缺血性腦卒中的有效手段。本研究擬通過觀察電針聯(lián)合豐富康復訓練激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/AKT)信號轉導通路相關因子的表達情況，探討其影響腦內血管新生以促進神經功能恢復的機制，為傳統(tǒng)針灸療法與現代康復技術的結合與運用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 選取SPF級健康雄性SD大鼠60只，2～2.5月齡，體質量為280～320 g，實驗動物生產許可證號為SCXK(魯)2019-0003。實驗過程中在自然條件下動物自由攝食和飲水，室溫為20～25 ℃，術前禁食不禁水。

1.2 試劑 AKT(2)：CST；PI3K p110(CC02181)：Bioworld；山羊抗小鼠IgG(137699)、山羊抗兔IgG(136080)、β-actin(18AV0406)：Zs-BIO；RIPA細胞裂解液(強)(051018180717)和Western blot一抗、二抗去除液(051418180626)：Beyotime；電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒(SF249607)：Thermo。

1.3 儀器 自動制冰機(IMS-20)：常熟市雪科電器有限公司；高速冷凍離心機(JW-3021HR)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；水平搖床(TS-1000)：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；純水機(Master-S30 UF)：上海和泰儀器有限公司；華佗牌一次性無菌針灸針(0.25 mm×13 mm)、電子針療儀(SDZⅡ型)：廣州市國覽貿易有限公司。

2 方法

2.1 模型復制方法及分組 隨機選取15只大鼠作為假手術組，僅作頸動脈分離，不插入尼龍線。其余大鼠參照Longa等[4]改良的頸外動脈線栓法復制腦缺血模型。用于模型復制的大鼠，經右側頸外動脈插線，建立局灶性大腦中動脈缺血動物模型。大鼠稱質量，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，將大鼠仰臥位固定于鼠板，在頸部右側作一切口，鈍性分離皮下組織，充分暴露頸總動脈，用縫合線標記頸總動脈，向下繼續(xù)剝離頸外動脈和頸內動脈，縫合線結扎頸外動脈遠心端，電凝筆電離頸外動脈，使用動脈夾暫時夾閉頸內動脈和頸總動脈，用動脈剪斜向上45°方向于頸外動脈殘端作一“V”型切口，將尼龍線經頸外動脈插入頸內動脈，插入約20 mm，微遇阻力時停止，表示線栓頭端已到達大腦中動脈起始段，此時即停止插線。常規(guī)術后操作，預防感染。參考Longa等[4]的5分制評分標準。0分：無神經損傷體征；1分：對側前爪不能完全伸展；2分：自主運動時，身體向偏癱側轉圈；3分：自主運動時，身體向對側傾倒；4分：意識喪失，不能自發(fā)行走。于大鼠清醒后進行神經功能缺損體征評分，評分1分及以上者即為模型復制成功。將模型復制成功的45只大鼠隨機分為模型組、針康組(電針聯(lián)合豐富康復訓練組)、抑制劑組(電針聯(lián)合豐富康復訓練組加抑制劑)，每組15只。每組取15只大鼠用于神經功能缺損評分，評分結束后將其中的3只用于腦梗死面積的檢測，6只用于缺血側腦組織PI3K、AKT陽性細胞的檢測，6只用于檢測缺血側腦組織PI3K、AKT蛋白的表達。

2.2 治療方法 電針組選穴為“百會”“風府”“內關”“心俞”4個穴位。參照普通高等教育“十三五”國家級規(guī)劃教材《實驗針灸學》，結合大鼠解剖結構定位。第1天術后4 h開始治療，用 0.30 mm×25 mm 毫針針刺，接SDZ-Ⅱ華佗牌電針治療儀，“百會”“風府”為一組，“內關”“心俞”為一組，近心端穴位接正極，遠心端穴位接負極。電針參數：疏密波，5～100 Hz，時間 20 min，每日1次，針康組和抑制劑組連續(xù)電針治療7 d。

豐富康復訓練包括豐富的環(huán)境與訓練療法。豐富的環(huán)境包括定時更換大鼠籠內物品，放置玩具、彩球、轉盤、搖鈴等，同時給予燈光、聲音刺激。訓練療法主要包括平衡木、轉棒、網屏訓練。平衡木訓練[5]：訓練大鼠的平衡功能，將大鼠放置于長為170 cm、寬為2 cm的木棒上，平放在距地面7 cm處。轉棒訓練[5]：可評估及訓練大鼠的動態(tài)平衡功能，將大鼠放置于長為150 cm、直徑為4.5 cm的木棒上，其中點固定在3 r/min的轉動器上，分別向左右交替轉動。網屏訓練[5]：評估大鼠抓握能力及肌力情況。將大鼠放在網帶為50 cm×40 cm、網眼為1 cm×1 cm的網屏上，網屏的左右和上方用木板制成邊框，網屏距離地面60 cm，下面鋪以海綿墊，防止大鼠前期因前爪抓力不夠摔傷。訓練時觀察大鼠是否會從網屏上掉下來或用前爪抓住網屏。針康組和抑制劑組，每天將大鼠置于豐富環(huán)境中，并置于平衡木、轉棒、網屏進行行走、抓握訓練各10 min，連續(xù)進行7 d。

抑制劑組大鼠處理方法：根據Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜，將用于微量注射的不銹鋼套管(長為10 mm，外徑為0.5 mm，內徑為0.3 mm)植入大鼠右側側腦室上方0.5 mm，確保插入的微量注射器下端能定位于側腦室，將AKT阻斷劑 Wortmannin(0.1 mmol/L)微量注射入側腦室，每日1次。待大鼠清醒后，再進行電針聯(lián)合豐富康復訓練，連續(xù)進行7 d。

2.3 指標觀察方法

2.3.1 大鼠神經功能評分 參考Longa等[4]的5分制評分標準，于各組大鼠治療7 d后進行神經功能缺損評分。

2.3.2 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法檢測大鼠腦梗死面積 于各組大鼠干預治療7 d后，水合氯醛腹部注射麻醉，快速取腦，置于-20 ℃冰箱20 min，取出后進行冠狀面切片，從額極開始每2 mm取一切片，將切片放置于培養(yǎng)皿中，避光條件下用2% TTC染色液進行染色，37 ℃水浴箱中孵育25 min后取出，用4%多聚甲醛固定。用數碼相機對擺放好的切片進行攝像，用圖像分析系統(tǒng)Image Pro Plus 6.0測量腦梗死面積。缺血部分面積占整個腦組織切片面積的百分比即為大鼠腦梗死面積比。

2.3.3 免疫組織化學法檢測PI3K、AKT表達水平 將腦組織石蠟切片，按照實驗常規(guī)流程依次進行鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(streptavidin-peroxidase，SP)顯色。步驟：烤片，脫蠟，脫水，阻斷滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，正常羊血清工作液封閉，一抗孵育過夜，滴加生物素標記的二抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液、DAB/H2O2反應染色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，出現棕黃色染色的細胞為陽性信號，計算陽性細胞數，以每個標本的積分光密度表示PI3K、AKT蛋白表達水平。

2.3.4 Western blot檢測PI3K、AKT蛋白的表達水平 取大鼠腦組織，加入RIPA細胞裂解液1 mL(內含1 mmol PMSF)進行裂解，于4 ℃離心( 12 000 r/min)10 min，收集上清液，在收集的蛋白樣品中按照1∶4加入5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，以充分變性蛋白。待樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。每孔加5～10 μL。濃縮膠所用電壓為80 V，時間為30 min；分離膠所用電壓為120 V，時間為1 h，電泳分離后，轉至PVDF膜(PI3K轉膜120 min，Akt轉膜60 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，而后進行一抗、二抗孵育。PBST洗膜后，用ECL法檢測各組大鼠蛋白表達情況，Image J軟件分析條帶灰度值，蛋白相對表達水平為目標蛋白與β-actin電泳條帶灰度值的比值。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 假手術組大鼠神經功能缺損評分為0；與假手術組比較，模型組神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)；干預7 d后，針康組較模型組神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)，抑制劑組較針康組神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注：A.假手術組；B.模型組；C.針康組；D.抑制劑組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與針康組比較，△P<0.05

3.2 各組大鼠腦梗死面積比較 假手術組腦梗死面積為0；與假手術組比較，模型組腦梗死面積顯著升高(P<0.05)；干預7 d后，針康組較模型組腦梗死面積顯著降低(P<0.05)，抑制劑組腦梗死面積明顯大于針康組(P<0.05)。見圖2、圖3。

注：A.假手術組；B.模型組；C.針康組；D.抑制劑組

圖2 各組大鼠腦梗死區(qū)域大體形態(tài)(TTC染色)

注：A.假手術組；B.模型組；C.針康組；D.抑制劑組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與針康組比較，△P<0.05

3.3 免疫組織化學法檢測的各組大鼠缺血側腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平比較 假手術組大鼠缺血側腦組織有少量PI3K、AKT表達；與假手術組比較，模型組大鼠PI3K、AKT表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，針康組大鼠PI3K、AKT表達水平顯著升高(P<0.05)；與針康組比較，抑制劑組大鼠PI3K、AKT表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5。

圖4 免疫組織化學法檢測的各組大鼠缺血側腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平比較(SP法染色，10×40倍，箭頭示陽性細胞)

注：A.假手術組；B.模型組；C.針康組；D.抑制劑組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與針康組比較，△P<0.05

3.4 Western blot法檢測的各組大鼠缺血側腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠缺血側腦組織PI3K、AKT蛋白的相對表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，針康組大鼠缺血側腦組織PI3K、AKT蛋白的相對表達水平顯著升高(P<0.05)；與針康組比較，抑制劑組大鼠缺血側腦組織PI3K、AKT的蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注：A.假手術組；B.模型組；C.針康組；D.抑制劑組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與針康組比較，△P<0.05

4 討論

腦卒中在《黃帝內經》中又稱之為“仆擊”“薄厥”“偏枯”等，其病機歸納起來不外風、火、痰、氣、虛、瘀六端，在這些病理因素的相互影響和相互作用下，臟腑陰陽失調，氣血逆亂， 上犯于腦而發(fā)病。“病變在腦，首取督脈”，故治督脈可通髓達腦，醒神開竅。百會為督脈要穴，別名“三陽五會”?！稌樉膶W》載：“百會者，五臟六腑奇經三陽百脈之所會，故名百會。”百會穴位于巔頂，為足少陽、足太陽、足厥陰與督脈的交會穴，具有升陽固脫、安神健腦、醒腦開竅等作用。風府為督脈經穴，督脈為陽脈之海，總督一身之陽氣，風府又為治風要穴，故針刺風府可祛風通絡、提振陽氣。內關為心包經絡穴，心俞為心的背俞穴，心主血脈，針此二穴可促進氣血運行。有相關研究[6-7]報道，這些腧穴在促進神經再生，改善內皮功能，改善心肌供血，調節(jié)下丘腦中樞和腦電活動等心腦效應方面作用顯著。故本實驗針刺處方選用督脈經穴百會、風府，輔以內關、心俞，運用電針治療以醒神開竅、調督通絡。

腦卒中發(fā)生后，促進血管的生成可加快神經功能恢復，重建的神經血管單元可為腦卒中恢復提供新的機會[8]。PI3K/AKT、Notch、Wnt/β-catenin等[9-12]多個信號通路參與血管新生過程，PI3K/AKT信號通路是血管生成各類信號通路的調節(jié)中心[13]。研究[14]發(fā)現，PI3K/AKT信號通路可調控血管新生，促進內皮細胞的增殖、遷移和歸巢，提高細胞生存能力和抑制內皮細胞衰老死亡。當機體在缺血、低氧等外界因素刺激下，PI3K/AKT信號通路被激活。PI3K是細胞內信號轉導的重要信使，具有調節(jié)細胞新陳代謝、增殖、凋亡的作用，同時參與AKT依賴性信號通路的活化。AKT作為PI3K信號轉導通路的下游重要靶點，是一種能夠促進細胞存活，抑制細胞凋亡，且能夠維持神經系統(tǒng)正常功能的重要信息分子[15-16]。AKT可以介導包括血管內皮細胞在內的多種細胞的生長，其活性的實現需要依賴第473位絲氨酸的磷酸化，促進血管生成信號，直接誘導血管生成[17]。

研究[18-19]發(fā)現，電針聯(lián)合康復訓練可通過對血管新生抑制因子的負反饋調節(jié)，發(fā)揮血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGFR2等血管新生相關因子的血管生成作用。VEGF是目前發(fā)現的最強烈、最有效、最重要的血管新生促進因子，通過與跨膜酪氨酸激酶受體VEGF1和VEGF2結合，可激活PI3K/AKT信號通路促進血管生成。本實驗研究結果顯示，針康組大鼠腦梗死面積、神經功能評分和PI3K/AKT表達量顯著優(yōu)于模型組、抑制劑組，這可能是由于電針聯(lián)合豐富康復訓練增加腦缺血大鼠缺血側腦組織PI3K/AKT的表達，激活PI3K/AKT信號通路誘導血管新生，從而減小腦梗死面積，改善神經功能評分，促進腦缺血大鼠神經功能恢復。

本實驗觀察電針聯(lián)合康復訓練對PI3K/AKT信號通路的影響，進一步探討電針聯(lián)合豐富康復訓練促進腦功能恢復的機制，為傳統(tǒng)針灸療法與現代康復技術的結合與運用，提供新的實驗依據。