ECR-1030M樹脂固定化單寧酶

張帥，程昊 *，許子婷

1. 肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院（肇慶 526061）；2. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）；3. 蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心（南寧 530004）

單寧酶（Tannase，EC 3.1.1.20）是一種主要由絲狀真菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，可高效水解沒食子酰單寧、鞣花單寧以及沒食子酸烷基酯等化合物，因而在沒食子酸生產(chǎn)、速溶茶除沉淀、果汁脫澀、單寧廢水去污等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。然而，由于單寧酶生產(chǎn)成本較高，且使用率和穩(wěn)定性較差，因而目前尚難以實現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用[5-6]。采用有效的固定化技術(shù)制備固定化單寧酶，不僅可以將單寧酶多次循環(huán)使用從而降低單寧酶使用成本，而且還可以提高單寧酶的理化性質(zhì)及生物穩(wěn)定性[7-8]，因而對于實現(xiàn)單寧酶的連續(xù)催化和工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。

目前，已報道的單寧酶固定化載體主要是殼聚糖和海藻酸鈣/鈉兩種材料[7-14]，另外如單寧微球[15]、微乳凝膠[16]、玉米芯[17]等僅有少量報道。這些固定化載體雖然有的具有較高的酶活回收率，但材料成本較高，難以實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用；有的材料雖然成本低廉，但固定化酶活力及使用效率較低，不具備產(chǎn)業(yè)化意義。樹脂材料由于類型多、成本低且具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)，已作為酶載體用于酶制劑的固定化研究[18]，且很多已實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，如Novozym 435便是將南極假絲酵母B脂肪酶固定于大孔丙烯酸樹脂上獲得的固定化酶產(chǎn)品[19]。關(guān)于單寧酶的樹脂固定化，目前僅王揮等[20]用一種LX-1000HA樹脂對黑曲霉單寧酶進(jìn)行了固定化研究，但其酶活回收率較低，僅為45.25%。

試驗以價廉易得且宜用于酶固定化的樹脂材料為載體，對米曲霉單寧酶進(jìn)行固定化研究，篩選出適宜的固定化樹脂并確定最優(yōu)的固定化工藝條件，同時對樹脂固定化單寧酶進(jìn)行性能測定，旨在建立一條可望產(chǎn)業(yè)化的固定化單寧酶生產(chǎn)工藝，以期實現(xiàn)單寧酶的的工業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

米曲霉（Aspergillus oryzae），肇慶學(xué)院食品微生物實驗室4℃斜面保藏。

活化培養(yǎng)基：將PDA培養(yǎng)基粉末（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）依說明書配好后分裝試管，滅菌后做成PDA斜面若干，4℃冷藏備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：水50%，麩皮35%，蔗糖6%，單寧酸5.5%，硝酸銨3%，氯化錳0.3%，氯化鈣0.2%，置于250 mL三角瓶，攪拌均勻。上述百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分比。

1.2 主要藥品

單寧酸、戊二醛、沒食子酸丙酯（PG）及其他常規(guī)藥品均為國產(chǎn)分析純；PG標(biāo)準(zhǔn)液配制：準(zhǔn)確稱取0.042 g PG，先以2滴無水乙醇溶解，再用100 mL水定容，現(xiàn)用現(xiàn)配；選用8種樹脂（杭州創(chuàng)科生物科技有限公司）作為單寧酶固定化載體，各樹脂特點(diǎn)見表1。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

無菌條件下，將米曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72 h，即得活化菌種。

表1 樹脂載體一覽表

1.3.2 接種劑制備

配制0.85%生理鹽水，分裝若干25 mL含玻璃珠的三角瓶，10 mL/瓶。滅菌并冷卻后，取一環(huán)活化菌種置于三角瓶中，封口，并以150 r/min振搖30 min，使菌體均勻分散在生理鹽水中，即得接種劑。

1.3.3 單寧酶發(fā)酵

取1 mL接種劑，均勻噴灑于發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分振蕩三角瓶使菌體均勻散布于培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)96 h，使米曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶。其間，分別于24和48 h時振蕩培養(yǎng)基（翻曲）1 min。

1.3.4 單寧酶提取

發(fā)酵結(jié)束后，向三角瓶中加入100 mL蒸餾水，以150 r/min振蕩30 min充分浸提單寧酶。然后將瓶中內(nèi)容物倒入離心瓶中，以5 000 r/min離心15 min，取上清液，即為粗酶液。

1.3.5 粗酶液超濾濃縮

用切割分子量（MWCO）10 kDa的中空纖維膜對粗酶液進(jìn)行超濾。超濾濃縮至粗酶液容積的1/4左右，可去除大部分沒食子酸等小分子物質(zhì)。

1.3.6 單寧酶活力測定

參考張帥等[21]的紫外分光光度法測定。對于固定化單寧酶活力的測定，用0.2 g固定化酶代替0.2 mL酶液，其他方法步驟不變。

1.3.7 固定化載體預(yù)處理

1) 陰離子交換型樹脂（MI-BN4）：①水振蕩沖洗1 h；②2.5%鹽酸溶液振蕩沖洗2 h；③水洗至pH接近中性；④4% NaOH溶液振蕩沖洗2 h；⑤水洗至pH接近中性；⑥用PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH 7，下同）振蕩平衡2 h；⑦過濾備用。

2) 陽離子交換型樹脂（MI-150IDA）：①水振蕩沖洗1 h；②4% NaOH溶液振蕩沖洗2 h；③水洗至pH接近中性；④5%鹽酸溶液振蕩沖洗2 h；⑤水洗至pH接近中性；⑥用PBS緩沖液振蕩平衡2 h；⑦過濾備用。

3) 靜電吸附和大孔吸附型樹脂（MA-P9、MANP6、ECR-1030M、ECR-8806M）：①乙醇振蕩浸泡2 h；②過濾；③丙酮振蕩浸泡2 h；④過濾；水振蕩沖洗至無有機(jī)溶劑殘留；⑥過濾備用。

4) 共價偶聯(lián)型樹脂（MC-150EP、ECR-4204M）：①水振蕩沖洗2 h；②用PBS緩沖液振蕩平衡3次；③過濾備用。

1.3.8 單寧酶固定化方法

采用戊二醛交聯(lián)法。將8種樹脂浸于一定濃度的戊二醛水溶液中活化4 h，然后濾出樹脂，與單寧酶按一定比例加入到PBS緩沖液中，室溫下攪拌一定時間使單寧酶固定于樹脂中。通過比較固定化單寧酶活力篩選出最佳固定化載體。

1.3.9 單寧酶固定化工藝優(yōu)化

選取戊二醛濃度（X1）、固定化時間（X2）和料酶比（X3）三個因子進(jìn)行混合水平均勻設(shè)計，因子水平如表2所示。

表2 均勻設(shè)計因子水平

1.3.10 酶活回收率的測定

在最優(yōu)工藝條件下制備固定化單寧酶，然后參考韓春然等[15]的方法，按式（1）計算固定化單寧酶的酶活回收率。

式中：固定化酶總活力（U）=固定化酶活力（U/g）× 固定化酶質(zhì)量（g）；酶液總活力（U）=酶液活力（U/mL）×酶液體積（mL）；殘酶液活力（U）=濾出固定化酶后的酶液活力（U/mL）×殘酶液體積（mL）。

1.3.11 固定化單寧酶的保藏穩(wěn)定性

將固定化單寧酶在4℃下分別保藏0，5，10，15，20，25，30，35，40和45 d，然后進(jìn)行酶活測定，考察固定化單寧酶活力隨保藏時間的變化關(guān)系。

1.3.12 固定化單寧酶的循環(huán)使用次數(shù)

用0.2 g固定化單寧酶水解50 mL PG 標(biāo)準(zhǔn)液20 min，每次水解后將固定化單寧酶濾出、清洗并測定酶活力，然后再投入PG標(biāo)準(zhǔn)液中進(jìn)行下一次水解，直至酶活力降至不低于初始酶活力的70%，以此考察固定化單寧酶的循環(huán)使用次數(shù)。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理

各試驗均平行3次，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。用SAS 9.4（SAS Institute Inc，Cary，NC，USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合、模型構(gòu)建以及回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳樹脂載體的選擇

由圖1可看出，用ECR-1030M樹脂制備的固定化單寧酶活力為1 465.8 U/g，明顯高于用其他樹脂材料制備的固定化單寧酶的活力，固定化效果非常理想。ECR-1030M樹脂是二苯乙烯交聯(lián)的甲基丙烯酸酯聚合物，為白色球狀微粒，粒徑為300～700 μm，孔徑25 nm，比表面積＞100 m2/g，理化性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械穩(wěn)定性良好，酶固載容量和固定化效率較高，適合固定米曲霉單寧酶。

圖1 不同樹脂載體制備的固定化單寧酶活力

2.2 最優(yōu)固定化工藝的確定

用DPS 9.0（浙江大學(xué)，杭州）構(gòu)建最優(yōu)U20(41×52)均勻設(shè)計表，試驗次數(shù)20次，最大迭代次數(shù)1 000次，尋優(yōu)時間5 min，運(yùn)行時間18 s，中心化偏差CD= 0.124 7[22-23]。ECR-1030M樹脂按此試驗方案制備的固定化單寧酶的酶活力（Y）結(jié)果如表3所示。

由表3可看出，6號試驗所得固定化單寧酶的活力最高，為1 470.5±26.3 U/g。為進(jìn)一步尋優(yōu)，用SAS 9.4對試驗結(jié)果進(jìn)行擬合[24]，可得二階回歸模型：Y=961.958 46X1+226.304 96X2+66 733X3-103.140 00X12- 32.595 00X1X2-10.984 05X22-1 147.884 86X1X3+ 102.153 25X2X3-500 116X32-2 907.153 85。

表3 均勻試驗結(jié)果

參數(shù)估計及顯著性分析如表4所示，模型方差分析如表5所示。

由表4可知，戊二醛濃度（X1）和料酶比（X3）分別對響應(yīng)指標(biāo)酶活力（Y）有顯著（p＜0.05）和極顯著（p＜0.01）影響，而固定化時間（X2）則對酶活力影響不顯著（p＞0.05）。由表5可知，二階回歸模型顯著（p＜0.05），說明該模型擬合良好，可以用該模型對ECR-1030M樹脂固定單寧酶工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4 參數(shù)估計及顯著性檢驗

表5 方差分析

在輸出的特征值結(jié)果中，顯示穩(wěn)定點(diǎn)為最大值（Stationary point is a maximum），且當(dāng)X1=3.444 158，X2=5.485 748，X3=0.063 325時，穩(wěn)定點(diǎn)預(yù)測值（Predicted value at stationary point）為1 483.054 648，略高于表3中6號試驗結(jié)果1470.5。為便于實際操作，選擇X1=3.5，即戊二醛濃度3.5%；X2=5.5，即固定化時間5.5 h；X3=0.063，取料酶比1∶16（g/mL），在此工藝條件下做3次平行試驗，制備的固定化單寧酶活力為1 480.5±32.6 U/g，這與穩(wěn)定點(diǎn)預(yù)測值基本一致，表明所構(gòu)建的二階回歸模型合理、可靠，可以很好地預(yù)測實際生產(chǎn)中單寧酶的固定化。

另外，按照最優(yōu)工藝，在16 mL單寧酶液中加入1 g ECR-1030M樹脂，并以3.5%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，固定5.5 h后獲得的固定化單寧酶總活力為1 480.5 U/g，單寧酶液總活力為4 360 U/g，殘酶液總活力為2 065.4 U/g，求得酶活回收率為64.5%。

2.3 固定化單寧酶的保藏穩(wěn)定性

最優(yōu)固定化條件下獲得的ECR-1030M樹脂固定化單寧酶，其酶活力隨保藏時間的變化如圖2所示。ECR-1030M樹脂固定化單寧酶在4℃下保藏期間，隨著時間的延長，酶活力不斷下降。當(dāng)保藏至20 d時，固定化單寧酶還有81.4%的酶活力；保藏至30 d時，固定化單寧酶仍保留了超過70%的酶活力。此后隨著時間延長，酶活力下降速度增大，至45 d時，僅剩下初始酶活力的1/4。

圖2 固定化單寧酶的保藏穩(wěn)定性

2.4 固定化單寧酶的循環(huán)使用次數(shù)

由圖3可以看出，當(dāng)固定化單寧酶循環(huán)使用6次后，仍具有80.3%的酶活力，而使用10次后還有超過1/2的酶活力。這表明該工藝制備的固定化單寧酶可以多次有效循環(huán)使用，表現(xiàn)出良好的酶活穩(wěn)定性，因而有利于工業(yè)化應(yīng)用。

圖3 固定化單寧酶的循環(huán)使用次數(shù)

3 結(jié)論與討論

通過固態(tài)發(fā)酵米曲霉制備出單寧酶，然后進(jìn)行超濾濃縮。采用戊二醛交聯(lián)法，以不同類型的樹脂材料為載體對超濾濃縮后的單寧酶進(jìn)行固定化，通過對固定化酶活力的比較，確定二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附樹脂ECR-1030M為最佳固定化載體。然后設(shè)計均勻試驗，分別考察戊二醛濃度、固定化時間及料酶比3個因素對酶活力的影響，并構(gòu)建二階回歸模型Y=961.958 46X1+226.304 96X2+66 733X3-103.140 00X1

2-32.595 00X1X2-10.984 05X22-1 147.884 86X1X3+ 102.153 25X2X3-500 116X32-2 907.153 85。通過方差分析確定該模型顯著，戊二醛濃度和料酶比2個因素對試驗結(jié)果分別有顯著和極顯著影響。最后通過極值尋優(yōu)，確定最優(yōu)固定化單寧酶工藝條件：戊二醛濃度3.5%，固定化時間5.5 h，料酶比1∶16（g/mL）。在此條件下制備的固定化單寧酶活力最高，為1 480.5± 32.6 U/g。同時，在最優(yōu)條件下制備固定化單寧酶，酶活回收率為64.5%。另外，還對固定化單寧酶的保藏穩(wěn)定性和循環(huán)使用次數(shù)進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，固定化單寧酶在4℃下保藏至20 d和30 d時，仍分別具有超過80%和70%的酶活力。固定化單寧酶循環(huán)使用6次后，仍具有超過80%的酶活力。說明該工藝制備的固定化米曲霉單寧酶具有良好的保藏穩(wěn)定性并可以高活力多次使用。

此工藝所選用的單寧酶固定化載體為價格低廉且性質(zhì)穩(wěn)定的樹脂材料，投入生產(chǎn)中有利于降低產(chǎn)品成本。同時，制備的ECR-1030M樹脂固定化米曲霉單寧酶活力高、保藏穩(wěn)定性好、循環(huán)使用次數(shù)多，因而有望作為一種新型固定化酶制劑投入到工業(yè)應(yīng)用。下一步將對該固定化酶產(chǎn)品在單寧水解、果汁脫澀及沒食子酸制備等方面的實際應(yīng)用展開研究。