煙用熱熔膠中酚類(lèi)抗氧化劑的測(cè)定

牛佳佳，張艷芳，李 棟，陳 宸，余晶晶，葉長(zhǎng)文，賀 琛，陳連芳，高 鳳

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2.河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊市維明南大街1 號(hào) 050051

3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都市錦江區(qū)成龍大道1 段56 號(hào) 610066

煙用熱熔膠是以熱塑性樹(shù)脂或彈性體（一般為乙烯-醋酸乙烯樹(shù)脂，EVA）為基料，添加增黏劑、增塑劑、抗氧化劑、阻燃劑及填料，經(jīng)熔融混合而成的固態(tài)黏合劑。其在常溫下為固體，加熱到一定溫度后能熔融形成可流動(dòng)且具有一定黏性的液體。煙用熱熔膠是卷煙生產(chǎn)中重要的煙用材料之一，主要用于濾棒成型紙、卷煙條與盒、煙箱等的粘接［1-2］。

抗氧化劑廣泛用于橡膠、塑料和黏合劑等高分子聚合物中，以防止聚合物材料因氧化降解而失去強(qiáng)度和韌性。煙用熱熔膠常用于濾棒成型，由于其在使用過(guò)程中需加熱融化，因此熱熔膠生產(chǎn)中常加入一定量抗氧化劑來(lái)增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性［3］。國(guó)內(nèi)外食品接觸材料法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了許可使用的抗氧化劑及使用要求。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 9685—2016［4］許可使用2,6-二特丁基-4-甲基苯酚（BHT），且有最大殘留量（QM）或特定遷移量（SML）的限制要求，如聚乙烯、聚丙烯塑料中BHT的QM 為0.5%；歐盟食品接觸材料法規(guī)［5］對(duì)此也有詳細(xì)的規(guī)定，如食品接觸涂層中BHT 的QM 為0.5%，SML 為3 mg/kg。食品添加劑領(lǐng)域也有抗氧化劑使用的具體規(guī)定，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014［6］許可使用丁基羥基茴香醚（BHA）、特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）等抗氧化劑，且有嚴(yán)格的用量要求。準(zhǔn)確測(cè)定煙用熱熔膠中的酚類(lèi)抗氧化劑含量對(duì)于卷煙工業(yè)企業(yè)和熱熔膠生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行此類(lèi)添加劑的質(zhì)量監(jiān)控有重要意義。

近年來(lái)，涉及抗氧化劑的卷煙煙氣自由基、有害成分形成方面的研究［7-9］已有報(bào)道，但卷煙輔助材料中抗氧化劑的研究報(bào)道較少。關(guān)于抗氧化劑的測(cè)定，研究對(duì)象主要涉及食品、食品包裝材料、高分子材料等，一般以食品添加劑中限量使用的抗氧化劑為目標(biāo)物。例如：孟繁磊等［10］利用超高效液相色譜（UPLC）測(cè)定了食用油中10 種抗氧化劑；王國(guó)軍等［11］利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定了聚丙烯餐具中12 種抗氧化劑的遷移量。目前，關(guān)于食品包裝、高分子材料等樣品中抗氧化劑的測(cè)定已有國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法［12-13］。例如，SN/T 1504.4—2005［12］提供了采用HPLC 測(cè)定高密度聚乙烯中的6 種酚類(lèi)抗氧化劑的方法。此外，抗氧化劑的測(cè)定方法還有氣相色譜-質(zhì)譜法［14］、加壓毛細(xì)管電色譜法［15］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［16］等。目前，煙草行業(yè)尚未針對(duì)煙用熱熔膠產(chǎn)品建立抗氧化劑的測(cè)試方法。熱熔膠中含有大量的乙烯-醋酸乙烯聚合物、石蠟等基體物質(zhì)，如何在實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子有效提取的同時(shí)，盡可能地凈化提取液，減少基質(zhì)干擾是方法開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。為此，以煙用熱熔膠實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程可能使用以及食品和食品包裝領(lǐng)域常用的苯酚、TBHQ、BHA、BHT、2,4-二特丁基苯酚、2,6-二特丁基苯酚、四［β-（3,5-二叔丁基-4-羥基苯基）丙酸］季戊四醇酯（Irganox 1010）和β-（3,5-二叔丁基-4-羥基苯基）丙酸十八碳醇酯（Irganox 1076）等8 種抗氧化劑為目標(biāo)物，通過(guò)考察前處理?xiàng)l件、色譜參數(shù)等，建立一種快速、高效、可操作性強(qiáng)的煙用熱熔膠中酚類(lèi)抗氧化劑的超高效液相色譜（UPLC）分析方法，旨在為煙用熱熔膠的質(zhì)量監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

10 個(gè)用于濾棒成型的熱熔膠樣品，2018 年取樣于濾棒生產(chǎn)車(chē)間機(jī)臺(tái)，編號(hào)為1～10。

標(biāo)準(zhǔn)品：苯酚、TBHQ、BHA、2,4-二特丁基苯酚、2,6-二 特 丁 基 苯 酚、BHT、Irganox 1010、Irganox 1076（＞98%，百靈威科技有限公司）；四氫呋喃（使用前減壓蒸餾純化）、甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）。

Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、Empower 3 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；KQ-700DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BP221S 電子天平（感量0.0001 g，德國(guó)Sartorius 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；微孔有機(jī)濾膜（0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 樣品處理與分析

用刀片將熱熔膠樣品切成粒徑小于2 mm 的粒狀，混合均勻。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g 熱熔膠樣品，置于50 mL 錐形瓶中，加入5 mL 四氫呋喃，常溫下超聲提取2 h；加入15 mL 甲醇稀釋?zhuān)?18 ℃下放置10 min；過(guò)濾，用少量甲醇潤(rùn)洗固形物；合并濾液并用甲醇定容至25 mL，過(guò)有機(jī)濾膜后進(jìn)行UPLC 分析。色譜分析條件為：

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC@BEH（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：30℃；柱流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm。流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～15 min，20%～100%B；15～20 min，100%B。

以保留時(shí)間定性，采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

參照文獻(xiàn)［5，7］，分別以200、280 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。圖1 為8 種目標(biāo)物在200、280 nm 波長(zhǎng)下的色譜圖。由圖1 可以看出，在波長(zhǎng)200 nm 下，8種目標(biāo)物的色譜峰信號(hào)強(qiáng)度均明顯高于280 nm。另外，采用二極管陣列PDA 檢測(cè)器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行190～400 nm 全波段掃描，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，8 種目標(biāo)物在波長(zhǎng)200 nm 左右的吸光度均最高，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。

圖l 8 種目標(biāo)物在200 和280 nm 波長(zhǎng)下的色譜圖Fig.1 Chromatograms of eight targets at 200 and 280 nm

圖2 190～400 nm 下8 種目標(biāo)物的吸光度Fig.2 Absorbances of eight targets at 190-400 nm

2.1.2 流動(dòng)相

酚類(lèi)抗氧化劑分離中常用的流動(dòng)相是乙腈和水，例如，SN 1504.4—2005［12］中采用乙腈和水對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫。為了改善目標(biāo)物的色譜峰形，流動(dòng)相中常需要加入甲酸或乙酸。本實(shí)驗(yàn)中分別考察了乙腈-水、乙腈-1%甲酸水溶液、乙腈-1%乙酸水溶液等3 個(gè)流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，在相同的梯度條件下，甲酸、乙酸水溶液和純水流動(dòng)相體系條件下的目標(biāo)物色譜峰形接近，乙腈-水體系條件下8 種目標(biāo)物的分離度較高。因此，選擇乙腈和水作為流動(dòng)相。

進(jìn)一步考察了流動(dòng)相洗脫條件，結(jié)果表明，20%乙腈等度洗脫條件下可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的有效分離，但有部分目標(biāo)物的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（Irganox 1076 保留時(shí)間為42 min）。通過(guò)對(duì)洗脫程序的優(yōu)化，最終確定1.2 節(jié)所示的梯度洗脫程序，由圖1A 可以看出，在17 min 內(nèi)目標(biāo)物完全分離，表明分析效率較高。

2.1.3 色譜柱

考察了Waters ACQUITY UPLC@BEH（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、AgilentZORBAX Eclipse XDBC18（50 mm×2.1 mm，1.8 μ m）超高效色譜柱以及Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）常規(guī)色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果分別見(jiàn)圖3A～C?？梢钥闯?，Waters ACQUITY UPLC@BEH（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱對(duì)8 種目標(biāo)物的分離效果好，分析速度快，可滿足定性、定量分析要求。因此，選擇Waters ACQUITY UPLC@BEH 色譜柱。

圖3 不同色譜柱分離效果對(duì)比Fig.3 Comparing the separation effects by different columns

2.2 前處理?xiàng)l件的確定

根據(jù)熱熔膠樣品特點(diǎn)以及目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)，選擇甲醇、乙腈、三氯甲烷、四氫呋喃等溶劑進(jìn)行酚類(lèi)抗氧化劑的提取效果考察。結(jié)果表明：采用振蕩提取方式，樣品均難以溶解；在超聲條件下，四氫呋喃、三氯甲烷兩種溶劑可使樣品完全溶解，但不同樣品溶解耗時(shí)差異較大；超聲萃取2 h可使樣品完全溶解，且通過(guò)對(duì)比四氫呋喃、三氯甲烷的測(cè)試數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)之間無(wú)明顯差異。考慮到三氯甲烷不易購(gòu)得（根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第445 號(hào)《易制毒化學(xué)品管理?xiàng)l例》可知，三氯甲烷屬于第二類(lèi)管制化學(xué)品），因此選擇四氫呋喃為溶劑且超聲2 h 的提取條件。

樣品提取液中含有大量的熱熔膠基體物質(zhì)，如果直接進(jìn)樣則會(huì)嚴(yán)重污染色譜柱及管路等，因此須對(duì)提取液進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)采用向提取液中加入不良溶劑沉淀基體物質(zhì)的方法來(lái)去除熱熔膠基體，比較了甲醇、乙醇對(duì)熱熔膠基體的沉淀效果。提取液中加入甲醇后，出現(xiàn)塊狀沉淀；提取液中加入乙醇后，溶液呈懸濁狀。可見(jiàn)，甲醇去除基體效果更好（圖4A）。由圖4B 可知，甲醇和乙醇作為沉淀劑時(shí)，測(cè)試結(jié)果一致性均較好。將甲醇或乙醇沉淀后的沉淀物烘干后進(jìn)行稱(chēng)量，進(jìn)一步比較驗(yàn)證兩種溶劑對(duì)熱熔膠基體的沉淀效果，結(jié)果顯示，甲醇的沉淀效果明顯優(yōu)于乙醇。另外，增加-18 ℃冷凍處理步驟后，沉淀物的質(zhì)量均有所增加，因此，最終確定1.2 節(jié)所示的前處理?xiàng)l件。

圖4 甲醇、乙醇作為沉淀劑的效果對(duì)比Fig.4 Comparing the effects of methanol and ethanol as precipitants

2.3 工作曲線和檢測(cè)限

準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)樣25 mg，置于250 mL 容量瓶中，加入四氫呋喃甲醇混合溶液（1∶5，體積比），超聲3 min 溶解并定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05、0.1、0.5、1.0 和2.0 mL，分別置于5 個(gè)10 mL 的容量瓶中，用四氫呋喃甲醇混合溶液定容，得到0.5、1、5、10 和20 mg/L 5 個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

各取0.5 mL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照濃度由低到高的順序分別進(jìn)行UPLC-UV 測(cè)定，將測(cè)得的UV 峰面積（y）與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，mg/L）進(jìn)行線性回歸分析，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程。選擇合適的最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定10 次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。結(jié)果（表1）顯示，本方法工作曲線線性良好、檢出限低。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢測(cè)限Tab.1 Standard working curve and detection limit

2.4 回收率和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定方法的回收率。稱(chēng)取0.2 g 樣品，加入與其含量相當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2 節(jié)方法進(jìn)行前處理和分析，進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定加標(biāo)回收率和重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，方法回收率為90.9%～103.4%，RSD 為0.7%～6.7%，可以滿足定量分析要求。

表2 方法的回收率和精密度（n=6）Tab.2 Recovery and repeatability of the method（n=6）

2.5 穩(wěn)定性考察

稱(chēng)取0.2 g 樣品，加入與其含量相當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2 節(jié)方法進(jìn)行提取，分別在0、2、4、8、12、24 h 對(duì)處理好的樣品溶液進(jìn)樣測(cè)試。結(jié)果表明，8 種目標(biāo)物的RSD 為1.6%～4.2%，表明樣品處理液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法測(cè)定了10 個(gè)煙用熱熔膠樣品中8種抗氧化劑的含量。結(jié)果（表3）表明，所有樣品均檢出抗氧化劑。煙用熱熔膠中常用抗氧化劑以BHT、Irganox 1010 為 主，其 中BHT 含 量 為497.4 ～3 951.5 mg/kg，Irganox 1010 為456.3 ～7 990.5 mg/kg；少量樣品中檢測(cè)出2,4-二特丁基苯酚、2,6-二特丁基苯酚，含量均在500 mg/kg 左右。以歐盟食品接觸材料法規(guī)［5］要求的涂層中BHT 的QM 為0.5%來(lái)看，煙用熱熔膠樣品中BHT 的含量能夠滿足該要求。

表3 10 個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果①Tab.3 Test results of ten adhesive samples （mg·kg-1）

3 結(jié)論

采用四氫呋喃良性溶劑提取和甲醇不良溶劑去除熱熔膠基體的前處理?xiàng)l件，可使目標(biāo)物提取、凈化一步完成。以乙腈-水為流動(dòng)相，利用UPLC梯度洗脫，建立了煙用熱熔膠中苯酚、TBHQ、BHA、2,4-二特丁基苯酚、2,6-二特丁基苯酚、BHT、Irganox 1010、Irganox 1076 等8 種抗氧化劑的測(cè)定方法。方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確（回收率90.9%～103.4%）、精密度良好（RSD≤6.7%）、檢測(cè)靈敏（檢測(cè)限0.008～0.028 μg·mL-1）、分析速度快（儀器運(yùn)行17 min），適用于煙用熱熔膠中酚類(lèi)抗氧化劑的測(cè)定。實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果表明，煙用熱熔膠樣品中抗氧化劑以BHT、Irganox 1010 為主，未發(fā)現(xiàn)苯酚、TBHQ、BHA、Irganox 1076 等食品及食品接觸材料中其他常見(jiàn)的抗氧化劑或污染物。