SPE-HPLC-MS/MS法同時測定電子煙煙液中9種甜味劑

廖惠云，吳 洋，馬夢婕，朱懷遠，曹 毅，陳晶波，張 華，朱龍杰，張 媛，袁益來

江蘇中煙工業(yè)有限責任公司，南京市建鄴區(qū)興隆大街29 號 210019

自2004 年以來，電子煙經(jīng)過發(fā)展已具備一定規(guī)模［1-2］。電子煙煙液是電子煙的重要組成部分，其主要成分是含煙堿的丙二醇、甘油或乙二醇等，同時為滿足不同抽吸者的需求，亦會添加各種香精［3-5］。文獻報道在電子煙煙液等新型煙草制品中檢出甜味劑［6-7］。甜味劑是賦予食品甜味的功能性食品添加劑。我國食品添加劑相關(guān)標準允許使用10 余種合成甜味劑，并規(guī)定了其在不同食品中的使用限量［8］。合理使用人工合成食品甜味劑是安全的；但如果超限量、超范圍，則會對消費者的健康產(chǎn)生一定負面影響［9］。因此，建立具有高通量、高準確度、高靈敏度的甜味劑檢測方法，加強電子煙煙液添加劑使用監(jiān)管就顯得尤為必要。

目前，對于甜味劑的測定主要集中于飲料、白酒、乳制品等［10-11］，分析方法分別有液相色譜法［12-13］、離子色譜法［14-15］、毛細管電泳法［16-17］、氣相色譜法［18-20］等，以液相色譜法為主。因不同甜味劑理化性質(zhì)、電化學性質(zhì)差異較大，液相色譜法很難滿足多種甜味劑同時檢測的需求，離子色譜法、毛細管電泳法等也因靈敏度低等原因應用不多，因而有必要開發(fā)簡單快速、靈敏度高的檢測方法。HPLC-MS/MS 技術(shù)由于具有檢測通量大、準確靈敏的特點，被廣泛用于食品領域的檢測，應用該技術(shù)同時分析多種甜味劑已經(jīng)成為一種趨勢［11］?？紤]到食品工業(yè)對甜味劑的使用大多以復配形式添加，在相關(guān)研究基礎上［6-7，21］，本研究中建立了固相萃取-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-HPLC-MS/MS）法同時測定電子煙煙液中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、新橙皮甙二氫查爾酮、紐甜和甜菊糖苷9 種甜味劑的質(zhì)量分數(shù)，旨在為電子煙煙液中甜味劑的檢測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

8 種不同品牌市售電子煙煙液，編號為1#～8#，其中1#～6#為煙草原味，7#為薄荷味，8#為水果香味。

安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、新橙皮甙二氫查爾酮、紐甜和甜菊糖苷（標準品，≥98.0%，美國Aladdin 公司）；華法林鈉（內(nèi)標，≥98.0%，浙江瑪雅試劑有限公司）；甲醇、乙腈（HPLC 級，美國Tedia 公司）；甲酸（色譜純）、乙酸銨（AR）（國藥集團化學試劑有限公司）。

1260/6460超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（配備電噴霧電離源，美國Agilent公司）；KQ-500DE超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；EVA08 全自動定量濃縮儀（北京普立泰科儀器有限公司）；T201 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；C18硅膠鍵合固相萃取柱和Oasis HLB 固相萃取柱（500 mg/6 mL，美國Waters 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液的配制

（1）內(nèi)標溶液和標準儲備液

準確稱量5 mg 華法林鈉（精確至0.1 mg），用水溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用超純水定容，配制成濃度為500μg/mL 的內(nèi)標溶液。分別準確稱取6 mg 安賽蜜、14 mg 糖精鈉、6 mg 甜蜜素、14 mg 三氯蔗糖、3 mg 阿斯巴甜、3 mg 阿力甜、12 mg新橙皮苷、1 mg 紐甜、10 mg 甜菊糖（精確至0.1 mg），用體積分數(shù)為10%的甲醇水溶液溶解并轉(zhuǎn)移至同一個100 mL 容量瓶中，定容，制得9 種甜味劑的混合標準儲備液。

（2）標準工作溶液

分別準確移取0.05、0.125、0.5、1.25、2.5 和5 mL混合標準儲備液，以及各0.5 mL 內(nèi)標溶液，用水定容至10 mL 容量瓶中，配制得到6 級標準工作溶液。

1.2.2 樣品處理與分析

準確稱量0.5 g 電子煙煙液（精確至0.1 mg），轉(zhuǎn)移至50 mL 具塞錐形瓶中，準確加入500μL 內(nèi)標溶液和10 mL 水，然后于60%功率條件下超聲萃取40 min，結(jié)束后搖勻，得萃取液。接著使用C18硅膠鍵合固相萃取柱對萃取液進行凈化，即先加5 mL 甲醇對柱子進行活化，再加5 mL 水進行平衡，使柱子上篩板保留少部分水，然后移取1 mL 萃取液上樣，棄去從柱子下篩板流下的溶液，再使用6 mL 體積分數(shù)為70%的甲醇水溶液進行淋洗，收集淋洗液。于70 ℃條件下將淋洗液氮吹濃縮至1 mL，進行HPLC-MS/MS 分析。分析條件：

色譜柱：Waters XBridge C18柱（150 mm×2.1 mm，填料粒徑3.5 m）；柱溫：40 ℃；進樣量：5μL；流速：0.2 mL/min；流動相：甲醇（A），5 mmol/L 乙酸銨的水溶液（B）；梯度程序：0～15 min，A 由15%上升至90%，B 由85%下降至10%，15～22 min 為90%A和10%B，22～25 min 為15%A 和85%B；離子源：ESI；離子源溫度：100 ℃；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：9 L/min；霧化氣壓力：275.79 kPa；毛細管電壓：正離子4 000 V，負離子3 500 V；檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM）。詳細參數(shù)見表1。

表1 9 種甜味劑和內(nèi)標的MRM 參數(shù)Tab.1 MRM parameters of nine sweeteners and internal standard

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取最高濃度混合標準溶液，在ESI 源正離子和負離子模式下進行質(zhì)譜全掃描檢測，得到被測化合物一級質(zhì)譜圖，找出每個化合物對應的母離子。然后進行二級質(zhì)譜掃描，得到相應子離子。對每個化合物找出兩對特征離子，分別進行裂解電壓及碰撞能量優(yōu)化，最后得到9 種甜味劑及內(nèi)標的較佳質(zhì)譜參數(shù)，見表1。結(jié)果顯示，阿斯巴甜、阿力甜和紐甜同屬二肽類化合物，在正離子模式下的響應較高，故采用［M+H］+作為母離子，而安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、華法林鈉、新橙皮甙二氫查爾酮和甜菊糖苷在負離子模式下響應較好，其母離子依次選擇為［M-K］－、［M-Na-2H2O］－、［M-Na］－、［M-2H］－、［M-H］－、［M-H］－和［M-H］－，其中三氯蔗糖一級質(zhì)譜圖中［M-2H］－（m/z 395）響應明顯大于其他離子，故采用［M-2H］－為其母離子。此外，二級質(zhì)譜圖顯示安賽蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、新橙皮甙二氫查爾酮和甜菊糖苷等的碎片離子較少，故依次選擇m/z 162、m/z 177、m/z 394.3、m/z 610.7 和m/z 802 為其對應的定性子離子。

2.2 色譜條件優(yōu)選

為優(yōu)選色譜條件，以加標樣品進樣溶液為對象，對比考察目標物在Waters XBridge C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 m）、ZORBAX Eclipse XDB-C18色 譜 柱（150 mm×2.1 mm，3.5 m）和ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 m）上的保留分離情況，目標物出峰情況見圖1a～圖1c。可知，1#～10#色譜峰（后續(xù)圖中編號順序相同）依次為安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、華法林鈉、新橙皮甙二氫查爾酮、紐甜和甜菊糖苷，目標物在3 根色譜柱上大都能被有效分離，其中4#三氯蔗糖和5#阿斯巴甜、7#華法林鈉和8#新橙皮甙二氫查爾酮在前兩根色譜柱上分別共流出，共流出目標物提取離子對色譜圖顯示能有效分離，而6#阿力甜、7#華法林鈉和8#新橙皮甙二氫查爾酮在ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱上共流出，共流出目標物提取離子對色譜圖顯示也能有效分離，且9#紐甜和10#甜菊糖苷出峰時間相比于前兩根色譜柱發(fā)生了交替。綜合考慮目標物整體出峰時間、響應大小及流動相消耗等情況，優(yōu)選Waters XBridge C18色譜柱為分析用色譜柱。

進一步對比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%（體積比）甲酸水溶液、乙腈-0.1%（體積比）甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨的水溶液和乙腈-5 mmol/L 乙酸銨的水溶液等不同流動相體系下目標物的色譜峰強度、峰形及分離效果。結(jié)果表明：乙腈為有機相時易導致個別組分共流出情況較甲醇嚴重，特別是極性較強的安賽蜜、糖精鈉及甜蜜素峰形較寬、分離度較差。此外，在相同的梯度洗脫條件下，水相中加入甲酸后，安賽蜜、糖精鈉及甜蜜素等有機鹽的色譜峰形拖尾比較嚴重?？傮w比較，以甲醇-乙酸銨水溶液為流動相，所得到的色譜圖峰形最好、響應強度較高，同時分離效果最好；另外為避免較高濃度的緩沖鹽體系對質(zhì)譜的影響，在滿足要求的情況下選用5 mmol/L 乙酸銨緩沖鹽體系。因此，最終確定甲醇-5 mmol/L 乙酸銨的水溶液為流動相。

在優(yōu)化后的梯度洗脫條件下，混合標準溶液中9 種甜味劑以及內(nèi)標的總離子流色譜圖如圖2所示。

圖1 不同色譜柱條件下9 種甜味劑和內(nèi)標的色譜峰Fig.1 Chromatogram peaks of nine sweeteners and internal standard using different chromatographic columns

圖2 優(yōu)化梯度洗脫條件下9 種甜味劑和內(nèi)標的色譜峰Fig.2 Chromatogram peaks of nine sweeteners and internal standard under optimized gradient elution conditions

2.3 固相萃取柱選擇及淋洗條件優(yōu)化

由于不同廠家煙液樣品中乙醇、丙三醇等的質(zhì)量分數(shù)不同，在進行液相色譜分離時這些醇類會對甜味劑在色譜柱中的保留性能產(chǎn)生影響。一般在分析甜味劑時，為了消減基質(zhì)干擾，文獻中常采用填料為C18、HLB 等固相萃取手段凈化樣品萃取液，以此來降低醇類等干擾物質(zhì)對色譜峰形的影響，而且還可以減少離子化過程對目標物帶來的干擾［10-11，21］。因為9 種甜味劑的分子結(jié)構(gòu)、極性大小各不相同，在固相萃取柱的保留行為差異較大，在參考相關(guān)文獻［6-7，21］的基礎上，對填料為C18和HLB 的固相萃取柱進行了優(yōu)選分析。取1 mL加標樣品溶液進行上樣和淋洗，收集各步驟的濾液，其中淋洗過程使用的溶劑按照洗脫強度從小到大的順序，甲醇的體積分數(shù)依次為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇水溶液，用量分別為1 mL，采用優(yōu)化好的儀器條件測定，考察各體積分數(shù)下目標物峰面積的變化情況，結(jié)果見圖3 和圖4?？梢钥闯?，就C18固相萃取柱而言，9 種目標物及內(nèi)標在棄去的從柱子下篩板流下的溶液中均未檢出，在淋洗液甲醇的體積分數(shù)為10%時，1#安賽蜜、2#糖精鈉、3#甜蜜素被淋洗下來，且體積分數(shù)為50%左右時能被全部淋洗下來；體積分數(shù)增為20%時，4#三氯蔗糖、5#阿斯巴甜、6#阿力甜、7#華法林鈉被淋洗下來，且體積分數(shù)為70%左右時能被全部淋洗下來；體積分數(shù)增至40%～50%時，8#新橙皮甙二氫查爾酮、9#紐甜和10#甜菊糖苷才被淋洗下來，且體積分數(shù)為90%左右時能被全部淋洗下來。相比而言，所有目標物在HLB 固相萃取柱的保留要更為強烈一些，主要原因是目標物在體積分數(shù)為20%時，1#安賽蜜、2#糖精鈉、3#甜蜜素才被淋洗下來；8#新橙皮甙二氫查爾酮、9#紐甜和10#甜菊糖苷在體積分數(shù)為90%時在柱子上仍有部分保留，最后使用100%甲醇才被全部淋洗下來。綜合考慮目標物在固相萃取柱上保留情況，基于保證各目標物回收率滿足分析的同時盡可能去除萃取液中干擾組分的原則，本研究中選擇C18固相萃取柱為凈化柱子，以及體積分數(shù)70%的甲醇水溶液為淋洗液。

進一步優(yōu)化淋洗液體積。取1 mL 加標樣品溶液進行上樣，丟棄柱子下篩板流下的溶液，再使用70%的甲醇水溶液進行淋洗，其中淋洗過程淋洗液使用體積分別為1、2、3、4、5、6、7 和8 mL，收集各體積條件下的濾液，濃縮至1 mL，采用優(yōu)化好的儀器條件測定，考察不同淋洗液用量下目標物峰面積的變化情況，結(jié)果見圖5?？梢钥闯觯褂? mL 淋洗液，能將1#安賽蜜、2#糖精鈉、3#甜蜜素、4#三氯蔗糖、5#阿斯巴甜全部洗脫下來。淋洗液體積增加至4 mL 左右時，能將保留更強的6#阿力甜、7#華法林鈉和8#新橙皮甙二氫查爾酮全部洗脫下來。淋洗液體積增加至6 mL 時，9#紐甜和10#甜菊糖苷幾乎100%被洗脫下來。因此，優(yōu)選淋洗液體積為6 mL。

圖3 C18固相萃取柱條件下淋洗液極性強度對9 種甜味劑和內(nèi)標峰面積的影響Fig.3 Effects of eluent polarity on peak areas of nine sweeteners and internal standard using C18 SPE column

圖4 HLB 固相萃取柱條件下淋洗液極性強度對9 種甜味劑和內(nèi)標峰面積的影響Fig.4 Effects of eluent polarity on peak areas of nine sweeteners and internal standard using HLB SPE column

圖5 不同淋洗液用量下9 種甜味劑和內(nèi)標峰面積的變化情況Fig.5 Effects of eluent polarity on peak areas of nine sweeteners and internal standard under different eluent volume conditions

2.4 樣品前處理條件優(yōu)化

為優(yōu)化樣品萃取方式及水平條件，以實測結(jié)果為陽性的5#煙液樣品（含有紐甜）為對象，考察振蕩萃取和超聲萃取方式下目標物質(zhì)量分數(shù)的變化情況，結(jié)果見圖6?？梢钥闯?，隨萃取時間延長，目標物質(zhì)量分數(shù)也逐漸升高，至40～50 min 時目標物萃取量基本達到最大值；整體上看，超聲萃取結(jié)果略微大于振蕩萃取結(jié)果。為此，在兼顧萃取結(jié)果與操作效率的基礎上，優(yōu)選樣品萃取方式為超聲萃取，萃取時間為40 min。

2.5 方法學驗證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限

圖6 不同萃取方式條件下目標物萃取量的變化情況Fig.6 Content of sweetener extracted by different extraction methods

采用優(yōu)化的HPLC-MS/MS 條件對系列標準工作溶液進行測定，以系列標準工作溶液中各目標物濃度與內(nèi)標濃度之比為橫坐標，以對應的色譜峰面積之比為縱坐標，求得線性回歸方程及其相關(guān)參數(shù)。以最低濃度標樣為對象，平行測定9 次，求分析結(jié)果的標準偏差，分別以3 倍和10 倍標準偏差對應值為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。如表2 所示，9 種甜味劑在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（回歸方程的R2均大于0.998），9種甜味劑的檢出限和定量限分別在0.005～0.287μg/mL 和0.017～0.956μg/mL 之間，可以滿足各目標物定量分析要求。

表2 9 種甜味劑的線性回歸方程、測試濃度范圍、R2、檢出限及定量限Tab.2 Regression equations,range of concentrations,correlation coefficients,limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of nine sweeteners

2.5.2 方法的準確度和精密度

參照相關(guān)標準檢測方法確認的回收率和精密度測試要求［22］，以樣品進樣溶液為對象，通過加標樣品的回收率實驗來驗證方法的準確度，并以RSD 來評價精密度。在低、中、高3 個不同濃度水平（分別為2、10 和20 倍LOQ）下進行回收率實驗，每個濃度水平重復測定6 次，計算樣品中各種甜味劑的回收率和RSD，結(jié)果見表3?？芍?，9 種甜味劑在不同濃度水平下的加標回收率在82.96%～114.01%之間，RSDs 在2.19%～5.18%之間，表明方法具有較好的準確度和重復性，能夠滿足微量目標物的定量分析。

表3 不同濃度下9 種甜味劑的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Tab.3 Spiked recoveries and RSDs of nine sweeteners at different concentrations（n=6） （%）

2.6 實際樣品的測定

采用本方法，對市售8 種不同品牌的電子煙煙液進行3 次平行測定，結(jié)果（表4）顯示在1 個樣品中檢出紐甜，質(zhì)量分數(shù)為5.92 mg/kg，且相對標準偏差＜5%?？偟目磥?，檢測結(jié)果符合GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中有關(guān)甜味劑的使用限量要求。

表4 實際樣品的測定結(jié)果Tab.4 Test results of commercial samples （mg·kg-1）

3 結(jié)論

①通過優(yōu)化目標物質(zhì)譜和色譜條件，以及優(yōu)化樣品凈化和提取方式，建立了SPE-HPLC/MS/MS 法同時測定電子煙煙液中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、新橙皮甙二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷等的方法。②在優(yōu)化條件下，目標物的檢出限和定量限分別介于0.005～0.287μg/mL 和0.017～0.956μg/mL 之間，加標回收率在82.96%～114.01%之間，RSDs 在2.19%～5.18%之間。③實際樣品檢測結(jié)果表明，定量結(jié)果準確可靠，可為電子煙煙液中甜味劑的篩查和檢測提供方法參考。