高效包埋硝化活性填料硝化特性及應(yīng)用研究

王少倫，楊宏

（北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實驗室，北京100124）

引 言

氨氮廢水的排放易于引發(fā)水體富營養(yǎng)化問題[1]。污水廠大多使用活性污泥法處理污水，活性污泥特異性差，無法更好地發(fā)揮出單一類菌群的處理能力，制約了污水處理能力的提升。另一方面，硝化細(xì)菌增殖速率緩慢，容易流失，對外界環(huán)境條件的變化敏感，對于寒冷地區(qū)相對較低的水溫或工業(yè)廢水相對復(fù)雜的水質(zhì)，氨氮硝化過程不理想仍然是生物脫氮過程的制約因素[2]。

相較于傳統(tǒng)的活性污泥法，包埋固定化技術(shù)成為了現(xiàn)今水處理行業(yè)的熱門研究對象[3]。同時，利用包埋固定化技術(shù)來實現(xiàn)低溫條件下的高效硝化是目前生物脫氮技術(shù)的研究熱點(diǎn)[4-5]。該技術(shù)能發(fā)揮出單一菌種的處理能力，特異性強(qiáng)，同時能維持較高的微生物濃度，增強(qiáng)微生物的高效性和耐受性[6-7]，在水處理領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。Li等[8]采用固定化硝化細(xì)菌處理氨氮廢水的實驗中，硝化速率達(dá)到39 mg·(L·h)-1。蘇姍等[9]采用硝化生物活性填料對市政污水進(jìn)行處理，在填充率為12%，DO 濃度為4～5 mg·L-1條件下，填料的最大氨氧化速率為30.20 mg·(L·h)-1。Inoue 等[10]以聚乙烯醇為載體固定硝化細(xì)菌，填充率為50%時處理低溫氨氮廢水，硝化速率為17 mg·(L·h)-1。前人對填料的制備研究往往局限于實驗室小規(guī)模，對實際污水研究少，更難以涉及解決低溫條件下硝化困難、出水難以達(dá)標(biāo)等問題；其次，填料活性低、處理效果差，影響了其工業(yè)化應(yīng)用。

基于上述的背景分析，本研究采用課題組研發(fā)的包埋硝化活性填料，經(jīng)活性恢復(fù)實驗后，重點(diǎn)考察了高效包埋填料對HRT、溫度的適應(yīng)性變化以及低溫、常溫條件下填料處理市政污水的實驗，并摸索了包埋細(xì)菌的生長規(guī)律，考察了填料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，旨在為實際應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗用水和污泥來源

實驗采用人工模擬氨氮廢水，主要成分有：NH4Cl、KH2PO4（根據(jù)NH4+-N 濃度調(diào)整，N∶P 為5∶1），MgSO4·7H2O(3 mg·L-1)，CaCl2(2 mg·L-1)。每升進(jìn)水中加入1 ml 微量元素，其中ZnSO4·7H2O(0.50 g·L-1)，Na2MoO4·2H2O(0.12 mg·L-1)，CoCl2·6H2O(0.20 mg·L-1)，MnCl2·4H2O(0.50 mg·L-1)，NiCl2·6H2O(0.70 mg·L-1)，CuSO4·5H2O(0.60 mg·L-1) 和FeCl3·6 H2O(0.80 mg·L-1)。污泥取自實驗室穩(wěn)定、高效的硝化反應(yīng)器，MLSS 為8000 mg·L-1，比氨氧化速率可達(dá)0.84 g·(g·d)-1。

1.2 包埋硝化活性填料的制備與實驗裝置

取上述污泥80 L，離心濃縮后（4%質(zhì)量干重）與質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% PVA 凝膠混合，加入添加劑碳酸鈣38.30 g·L-1，活性炭10 g·L-1[11-16]，均勻地涂在網(wǎng)筒狀結(jié)構(gòu)載體上，放入過飽和的硼酸溶液進(jìn)行交聯(lián)，用清水清洗后將載體切成長度1 cm、壁厚2 mm 的筒狀填料，填充于聚乙烯制成的懸浮球（直徑100 mm）中。實驗采用有機(jī)玻璃反應(yīng)器以連續(xù)流方式運(yùn)行，通過PCL 在線控制pH、DO、溫度等實驗參數(shù)，反應(yīng)器有效容積為180 L，包埋填料填充率為10%。

1.3 包埋填料活性恢復(fù)

將1.2 節(jié)新制作的包埋填料在適宜條件下通過不斷改變進(jìn)水氨氮負(fù)荷的方式，進(jìn)行活性恢復(fù)實驗，保持溫度為24℃，pH 為7.30～7.50，DO 為3～5 mg·L-1，HRT 為5 h。每天監(jiān)測進(jìn)出水氨氮濃度，以出水氨氮濃度≤20 mg·L-1作為指示標(biāo)準(zhǔn)，提高進(jìn)水氨氮濃度，從而保持底物充足，不斷提高氨氮去除效果，待氨氮去除能力達(dá)到穩(wěn)定后，即認(rèn)為包埋填料活性恢復(fù)完成。

1.4 包埋填料去除氨氮的影響因素

1.4.1 包埋填料對HRT 的適應(yīng)性變化 以高效包埋填料為考察對象，考察不同HRT 下硝化細(xì)菌活性的適應(yīng)性變化。DO 為5 mg·L-1，pH 為7.30～7.50，溫度為24℃，HRT 分別為5、3、1 h，通過測定進(jìn)出水氨氮濃度及氨氧化速率的變化來反應(yīng)硝化活性。

1.4.2 包埋填料對溫度的適應(yīng)性變化 以HRT 為1 h條件下穩(wěn)定運(yùn)行的包埋填料為考察對象，考察降溫過程和升溫過程對填料硝化活性的影響，下降溫度分別為24、20、16、12℃，上升溫度分別為16、20、24℃。

1.4.3 低溫下階段性增加HRT 對包埋填料硝化特性的影響 針對實驗室低溫條件下，出水氨氮不達(dá)標(biāo)現(xiàn)象，考察階段性增加HRT 對硝化活性及出水氨氮濃度的影響。HRT 分別為1、2、3 h，水溫為12℃，DO 為5 mg·L-1，pH 為7.30～7.50，進(jìn)水氨氮濃度為50 mg·L-1。

1.5 包埋填料處理低溫、常溫市政污水的實際應(yīng)用

市政污水為典型A2O處理流程的初沉池沉淀出水。該實驗考察高效包埋填料在低溫、常溫條件下處理市政污水的實驗效果。反應(yīng)器運(yùn)行參數(shù)：進(jìn)水氨氮為34.45～45.15 mg·L-1，pH 為7.17～7.42，DO 為5 mg·L-1，溫度分別為12、24℃。

1.6 分析方法

1.6.1 水質(zhì)分析方法 三氮的測定方法均為標(biāo)準(zhǔn)分析法[17]。NH4+-N 采用納氏試劑光度法測定(UV-1600)；NO2--N 采用N-(1-萘基)乙二胺光度法測定(UV-1600)；NO3--N 采用紫外分光光度法測定(UV-1600)；pH 采用在線儀表測定(YD-pH01)；DO采用在線儀表測定(YD-DO01)；溫度采用溫度控制器控制。

1.6.2 掃描電鏡分析 SEM 樣本與處理方法參照Liu 等[18]方法，實驗具體操作如下：取應(yīng)用實驗結(jié)束后的包埋填料，清洗后加入2.5%戊二醇溶液進(jìn)行固定，置于4℃冰箱中固定超過12 h，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3 遍，隨后進(jìn)行梯度（50%、70%、80%、90%、100%的乙醇）脫水，每次10～15 min，后用乙酸異戊酯置換，徹底脫水后冷凍干燥12 h，后進(jìn)行噴金處理，采用SU8020 掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6.3 熒光定量PCR 分析 分別取初始包埋填料、活性恢復(fù)結(jié)束后及市政污水應(yīng)用實驗結(jié)束后的包埋填料，分別標(biāo)記為A、B、C，從樣本中提取DNA 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，采用特異性引物對(amoA-1F、amoA-2R)對AOB amoA 功能基因進(jìn)行qPCR擴(kuò)增[19]。

qPCR 分 析 采 用 amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′ ) 和 amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)引物對[19]，分別對三個樣品的AOB菌基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析。采用SYBRGreen法進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，儀器為杭州朗基MG96+型PCR儀。樣品反應(yīng)體系與標(biāo)準(zhǔn)曲線PCR體系相同，根據(jù)抽提質(zhì)粒計算目的基因拷貝數(shù)，通過預(yù)實驗分別選取標(biāo)準(zhǔn)品的10-2～10-7稀釋液用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出未知樣品基因的表達(dá)量。

qPCR 具體反應(yīng)控制過程如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；在60～95℃之間制備熔解曲線確定基因特異性。完成上述步驟后，把加好樣本的96孔板放在博日9600plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 包埋填料活性恢復(fù)階段

從圖1中可以看出，隨著氨氮處理負(fù)荷的增加，包埋填料氨氧化效率開始快速增長，亞氮積累率升高，微生物的活性開始恢復(fù)。第1～9 d（DO 為3～4 mg·L-1）氨氧化速率處于快速增長階段，增長至63.22 mg·(L·h)-1，亞氮積累率達(dá)到72.73%；第10～14 d（DO 為4～5 mg·L-1）氨氧化速率呈中速增長階段，增長至89.04 mg·(L·h)-1；第15～18 d（DO 為4～5 mg·L-1）進(jìn)水氨氮控制在500 mg·L-1左右，氨氧化速率依然緩慢增加，最終增長至93.20 mg·(L·h)-1，亞氮積累率穩(wěn)定在76%左右，包埋填料實現(xiàn)了快速恢復(fù)。該實驗恢復(fù)周期短，硝化速率得到了大幅度提升，明顯優(yōu)于郝婧[20]的包埋顆粒氨氧化速率最高為30 mg·(L·h)-1的實驗研究。

圖1 包埋填料活性恢復(fù)過程Fig.1 Active recovery process of embedded filler

初始包埋填料效率增長緩慢，后期快速增長，原因可能是前期的包埋處理對硝化細(xì)菌的活性產(chǎn)生了負(fù)面影響，而后期細(xì)菌活性得到恢復(fù)以及硝化細(xì)菌在填料內(nèi)部不斷增殖。隨著微生物量持續(xù)增加，填料對氨氮的去除能力也不斷增強(qiáng)，這一點(diǎn)與2.5 節(jié)qPCR 結(jié)果是一致的。在恢復(fù)前期，亞氮積累率升高，這是因為包埋菌源中NOB 占有比例少，而后期出現(xiàn)了小幅度的下降，這可能與DO 的提高有關(guān)系。在低溶解氧環(huán)境下AOB 相對于NOB 對溶解氧具有更強(qiáng)的親和力，氧利用能力也較強(qiáng)，NOB 的生長會受到抑制[21-23]。

2.2 包埋填料去除氨氮的影響因素

2.2.1 包埋填料對HRT 的適應(yīng)性變化分析 水力停留時間(HRT)在一定程度上影響著系統(tǒng)處理效果，還直接決定了生物反應(yīng)器容積的大小。傳統(tǒng)的污水生物處理系統(tǒng)HRT 一般較長，保證出水水質(zhì)，但處理設(shè)施占地較大，影響到處理工程的基建投資[24]。針對高效包埋硝化活性填料，本實驗考察了填料在HRT 變化時對氨氮的去除效果，為今后處理市政污水、高氨氮工業(yè)廢水提供參考。

由圖2 所示，第7 d 和17 d 時HRT 分別調(diào)整為3 h 和1 h，進(jìn) 水 氨 氮 濃 度 分 別 為290.12 mg·L-1和102.36 mg·L-1。在改變條件后，出水氨氮濃度有所升高，氨氧化速率呈現(xiàn)不同程度的下降，隨后逐漸升高，并于第16 d 和26 d 分別達(dá)到85.67 mg·(L·h)-1和80.62 mg·(L·h)-1。氨氧化速率出現(xiàn)下降的原因可能是進(jìn)水負(fù)荷調(diào)整時，包埋填料受到?jīng)_擊，硝化活性受到不同程度的影響。同時，由于基質(zhì)和填料內(nèi)外溶解氧濃度梯度，使得硝化細(xì)菌易于分布在表層及淺表層[25]，部分細(xì)菌受沖擊流失，出水也檢測到了污泥的流失，從而導(dǎo)致氨氧化速率發(fā)生波動?？傮w來看，包埋填料能夠快速適應(yīng)水力條件的變化，HRT對包埋填料硝化特性影響較小。董亞梅等[26]采用包埋顆粒進(jìn)行的不同梯度的HRT 實驗同樣得出了HRT的改變對包埋顆粒硝化特性影響較小的結(jié)論。

為模擬處理市政污水，于27 d 將進(jìn)水氨氮濃度下調(diào)為50 mg·L-1，HRT仍為1 h，從圖2可以看出，出水氨氮濃度穩(wěn)定在1 mg·L-1以下，表明填料氨氮處理效果優(yōu)良。

2.2.2 包埋填料對溫度的適應(yīng)性變化分析 溫度不僅影響硝化菌的比增長速率，而且影響硝化細(xì)菌的活性[27]。本實驗?zāi)M了降溫、升溫兩個過程，考察了填料活性的變化規(guī)律，結(jié)果如圖3所示。

圖2 HRT對硝化活性的影響Fig.2 Effect of HRT on nitrification activity

由圖3 可知，進(jìn)水氨氮濃度都控制在50 mg·L-1左右。圖3(a)為降溫過程，隨著溫度的降低，氨氧化速率不斷下降，出水氨氮濃度不斷升高。當(dāng)水溫為24℃時，出水氨氮濃度最終穩(wěn)定在1 mg·L-1以下；水溫下降為20、16 和12℃時，出水氨氮濃度分別上升為5、10 和20 mg·L-1左右。圖3(b)為升溫過程，隨著溫度的增加，氨氧化速率逐漸升高，出水氨氮濃度不斷下降。當(dāng)水溫上升至16、20 和24℃時，出水氨氮濃度最終分別下降為6.23、2.87 和0 mg·L-1，優(yōu)于圖3(a)中降溫過程的氨氮去除效果，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的氨氮去除能力。

由圖3 降溫、升溫變化過程可見，當(dāng)調(diào)整溫度時，氨氧化速率都存在明顯的變化，而后趨于穩(wěn)定。該現(xiàn)象說明包埋處理后的硝化細(xì)菌對溫度變化仍然敏感，同時它具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，短時間內(nèi)能適應(yīng)溫度的變化，這與尚海源等[28]、Guo 等[29]實驗結(jié)果是一致的，從而證明其可以應(yīng)對季節(jié)性溫差變化，保障出水穩(wěn)定，具有相當(dāng)優(yōu)越的工程應(yīng)用價值。

圖3 溫度對硝化活性的影響Fig.3 Effect of temperature on nitrification activity

2.2.3 低溫下階段性增加HRT 對包埋填料硝化特性的影響 由2.2.2 節(jié)實驗可知，當(dāng)水溫為12℃時，最終出水氨氮濃度達(dá)到19.25 mg·L-1，為了提高氨氮去除效果，降低出水氨氮濃度，通過調(diào)整HRT，尋找該運(yùn)行條件下的最佳水力停留時間，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)增大HRT時，氨氮去除率會迅速升高。當(dāng)水溫為12℃、HRT 為1 h 時，氨氮去除率僅達(dá)到60%左右。在第5 d 時，將HRT 增大至2 h，氨氮去除率迅速升高，并穩(wěn)定在90%以上，此時出水氨氮在5 mg·L-1以下。在第11 d 時，將HRT 增大至3 h，出水氨氮迅速下降并維持在1 mg·L-1以下，進(jìn)水氨氮基本完全去除。HRT 的大小影響著污水處理廠的處理水量、效益以及工程的基建投資等多個方面，因而，較短的HRT 是應(yīng)用包埋固定化技術(shù)的巨大優(yōu)勢之一。

圖4 低溫條件下HRT對硝化活性的影響Fig.4 Effect of HRT on nitrification activity at low temperature

2.3 填料處理市政污水過程中去除氨氮效果分析

在考察了包埋填料對溫度、HRT 適應(yīng)性變化的基礎(chǔ)上，針對低溫、常溫條件下的市政污水，進(jìn)行包埋填料處理市政污水的應(yīng)用實驗。進(jìn)出水氨氮濃度和氨氮去除率變化情況如圖5所示。

由圖5可知，進(jìn)水氨氮濃度并不穩(wěn)定，平均濃度為39.97 mg·L-1。第一階段(1～10 d)水溫為12℃，HRT 為2 h，氨氮去除率開始僅為71.91%，低于處理人工廢水時的效果，第3 d 后逐漸增大，出水氨氮濃度逐漸降低并穩(wěn)定在5 mg·L-1左右。該現(xiàn)象說明包埋填料前期存在適應(yīng)復(fù)雜水質(zhì)的過程并且適應(yīng)能力較強(qiáng)。在第二階段(11～19 d)，將HRT 增大至3 h后，氨氮去除率迅速升高，出水氨氮濃度迅速降低并穩(wěn)定在1 mg·L-1以下。當(dāng)處于第三階段(20～29 d)時，HRT為1 h，水溫為24℃，改變條件后出水氨氮濃度稍有升高后迅速降低，并穩(wěn)定在1 mg·L-1以下，強(qiáng)于污水廠活性污泥的氨氮處理能力，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖5 包埋填料對市政污水中氨氮的去除效果Fig.5 Removal effect of ammonia nitrogen in municipal sewage with embedded filler

2.4 包埋填料SEM分析

圖6為包埋填料實物及填料切面不同放大倍數(shù)(20000、10000)的SEM 圖。如圖6 所示，包埋填料內(nèi)部有良好的孔隙度，即存在大量的供細(xì)菌附著生長的骨架結(jié)構(gòu)以及可用于傳輸氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的通道。因此，包埋填料為微生物提供了良好的生長微環(huán)境。同時內(nèi)部分布大量桿狀菌和球狀菌，充分說明包埋填料已經(jīng)成為了良好的微生物載體。

圖6 包埋填料實物及掃描電鏡圖Fig.6 Embedded filler and SEM images

2.5 qPCR結(jié)果分析

對三組包埋填料樣本中的AOB 進(jìn)行了熒光定量分析，PCR分析結(jié)果見表1。

樣本編號拷貝數(shù)×10-8/(copies/g)A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3定量值1.37 1.56 1.11 3.58 3.11 2.95 2.15 2.38 2.12平均值1.34 3.21 2.21

由表1 可以看出，樣本B 中種群豐度遠(yuǎn)大于A，表明經(jīng)過恢復(fù)階段后，硝化細(xì)菌不僅活性得到恢復(fù)，在填料內(nèi)部也不斷增殖。隨著微生物量持續(xù)增加，對氨氮的去除能力也不斷增強(qiáng)，從分子生物學(xué)層面上表現(xiàn)了高效包埋填料的優(yōu)勢，從而反映了填料內(nèi)部良好的生存環(huán)境。由此可見，活性恢復(fù)階段是形成高效包埋填料必不可少的階段。

樣本C 種群豐度低于樣本B，說明市政污水環(huán)境下包埋填料內(nèi)細(xì)菌數(shù)量是低于實驗室恢復(fù)階段的，可能是因為底物濃度低或者復(fù)雜水質(zhì)條件使得細(xì)菌數(shù)量維持在相對低水平。該填料的氨氧化速率同樣低于活性恢復(fù)后的填料，主要原因可能是由填料內(nèi)部細(xì)菌數(shù)量決定的。氨氧化速率與細(xì)菌的數(shù)量呈正相關(guān)，包埋填料對氨氮的去除效果會隨細(xì)菌數(shù)量的增加而增加，邵勇等[30]、鄧巖巖等[31]都通過實驗得出了載體內(nèi)微生物量增加，對氨氮的去除能力也不斷增強(qiáng)這一結(jié)論。同時，底物濃度、溫度、水質(zhì)等環(huán)境因素可能是決定細(xì)菌內(nèi)部數(shù)量的重要因素。

從細(xì)菌增殖衰亡現(xiàn)象可以看出，硝化細(xì)菌易在包埋填料中生長繁殖，此外，如果以更低的初始包埋細(xì)菌量進(jìn)行固定化，填料仍能具有較好的氨氮處理效果，這對于降低工程成本具有重要意義，此項實驗研究正在進(jìn)行中。

3 結(jié) 論

（1）采用薄層PVA 制作包埋填料，通過連續(xù)流恢復(fù)實驗實現(xiàn)了氨氧化速率93.20 mg·(L·h)-1的高表達(dá)。

（2）在常溫條件下，包埋填料硝化速率受HRT影響較小，均穩(wěn)定在80 mg·(L·h)-1以上，同時包埋填料能快速適應(yīng)降溫、升溫等季節(jié)性溫差變化，保障了出水穩(wěn)定。

（3）在市政污水低溫和常溫條件下，當(dāng)HRT 分別為3 h 和1 h 時，進(jìn)水氨氮基本完全去除，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的處理能力，表明包埋填料用于市政污水硝化是完全可行的。

（4）SEM 結(jié)果顯示包埋填料內(nèi)部有良好的孔隙度，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯；熒光定量PCR 結(jié)果顯示硝化細(xì)菌大量增殖，說明包埋填料為微生物提供了良好的生長微環(huán)境。