豆瓣醬生物胺降解菌株的篩選、鑒定及其降解特性研究

趙佳迪，單萬祥，鈕成拓，閔世豪，鄭飛云，劉春鳳，王金晶，李崎*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

生物胺是一類含氮有機(jī)化合物，廣泛存在于醬油、豆醬、香腸、魚露、奶酪、黃酒等發(fā)酵食品中，在食品中主要有以下8種：腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺。生物胺通常是微生物利用前體氨基酸進(jìn)行脫羧作用合成的[1-2]，例如，尸胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺分別由相應(yīng)的前體氨基酸賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和酪氨酸產(chǎn)生，腐胺是由鳥氨酸脫羧酶和胍丁胺脫氨酶產(chǎn)生[3]，亞精胺和精胺是由腐胺經(jīng)過胺合成酶產(chǎn)生，且兩者可以相互轉(zhuǎn)化[4]。人體，特別是那些由于藥物治療而導(dǎo)致胺氧化酶減少的人群，過量攝入生物胺會(huì)導(dǎo)致許多健康問題，如引發(fā)頭痛、低血壓、惡心、潮熱、局部炎癥、心悸、高血壓和消化等問題[5-7]。

豆瓣醬，是以蠶豆、面粉、辣椒及鹽水為主要原料發(fā)酵而成的傳統(tǒng)豆類調(diào)味食品，為多菌種開放式釀造，有多種微生物參與[8-9]，發(fā)酵過程中往往導(dǎo)致多種物質(zhì)生成，其中包含一些有毒物質(zhì)，如生物胺[10]。為了保障食品安全，需要控制生物胺的含量。目前主要的控制手段有輻照、氣調(diào)包裝、高靜水壓處理、添加食品添加劑和防腐劑等手段，但可能對(duì)人體有潛在危害[11-12]。近年來，安全環(huán)保的生物學(xué)方法越來越被消費(fèi)者所接受，如在食品發(fā)酵過程中添加降解生物胺的菌株控制生物胺的含量[13-14]。

由于豆瓣醬發(fā)酵過程具有較高的鹽含量，因此常見的微生物菌株無法生長。本課題組通過篩選得到既能適應(yīng)豆醬生產(chǎn)環(huán)境又能高效降解生物胺的菌株，并研究其在不同環(huán)境因素下的降解特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆瓣醬樣品來自于安徽某釀造食品有限公司。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、亞精胺、精胺、酪胺鹽酸鹽，美國Sigma公司；色胺、β-苯乙胺，瑞士Adamas Reagent公司；組胺二鹽酸鹽，加拿大Bio Basic公司。

前體氨基酸：鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸，上海阿拉丁試劑有限公司。

試劑：色譜級(jí)乙腈，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯甲酰氯，上海阿拉丁試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒GK1072，上海捷瑞生物工程有限公司。

磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)：Na2HPO4·12H2O 5.02 g，NaH2PO4·2H2O 1.1 g，去離子水1 L，pH 7.02。

以生物胺為唯一氮源培養(yǎng)基 (biogenic amines as the sole nitrogen source, BAs)：KH2PO42 g、檸檬酸銨2 g、NaCl 50 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、MnSO40.03 g、FeSO40.04 g、硫胺素0.01 g、葡萄糖2 g、腐胺二鹽酸鹽100 mg、尸胺二鹽酸鹽100 mg、亞精胺100 mg、精胺100 mg、色胺100 mg、苯乙胺100 mg、組胺二鹽酸鹽100 mg，酪胺鹽酸鹽100 mg，去離子水1 L。

改良MRS培養(yǎng)基 (modified MRS, MMRS)[15]：大豆蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，NaCl 50 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，K2HPO42 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，吐溫-80 1.0 mL,腐胺二鹽酸鹽100 mg，尸胺二鹽酸鹽100 mg，亞精胺100 mg，精胺100 mg，色胺 100 mg，苯乙胺100 mg，組胺二鹽酸鹽100 mg，酪胺鹽酸鹽100 mg，去離子水1 L。此培養(yǎng)基的改良之處是去除2種氮源牛肉膏和酵母粉，添加了生物胺為氮源，且添加NaCl與大豆蛋白胨適應(yīng)豆醬的高鹽及富含大豆蛋白的環(huán)境。

添加氨基酸的LB培養(yǎng)基 (LB+amino acids, LBA)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 50 g，鳥氨酸1 g，賴氨酸1 g，精氨酸1 g，色氨酸1 g，苯丙氨酸1 g，酪氨酸1 g，組氨酸1 g，去離子水1 L。

添加氨基酸的MRS培養(yǎng)基 (MRS+amino acids, MRSA)：大豆蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，NaCl 50 g，酵母粉5 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，K2HPO42 g，吐溫-80 1.0 mL，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，鳥氨酸1 g，賴氨酸1 g，精氨酸1 g，色氨酸1 g，苯丙氨酸1 g，酪氨酸1 g，組氨酸1 g，去離子水1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海博訊公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；氮吹儀，上海左樂儀器有限公司；Centrifuge 5804R型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；C18柱，Angilent, 4.6 mm×250 mm×5 μm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物胺降解菌株初篩

取5 g醬醅于100 mL錐形瓶中，加入50 mL生理鹽水，于搖床上充分振蕩混勻，取懸浮液梯度稀釋至10-5，每個(gè)梯度取100 μL懸浮液于BAs固體培養(yǎng)基和MMRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行涂布，并于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落生長良好，方可分離。

1.3.2 生物胺降解菌株復(fù)篩

一級(jí)復(fù)篩：將從BAs固體培養(yǎng)基和MMRS固體培養(yǎng)基分離的單菌落分別于LB和MMRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，調(diào)節(jié)初始OD值，使其在含有100 mg/L生物胺的磷酸鹽緩沖液(pH 7.02)中為0.8[16]，并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置24 h。24 h后測定加入菌株的緩沖液中的生物胺含量，并與未添加菌株的緩沖液(空白組)相比測定生物胺的降解率。

此外，從BAs固體培養(yǎng)基和MMRS固體培養(yǎng)基分離的單菌落分別于LBA培養(yǎng)基和MRSA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，并調(diào)節(jié)初始OD值使其分別在LBA和MRSA培養(yǎng)基中為0.1，并在37 ℃下放置24 h，測定生物胺產(chǎn)生量。優(yōu)先選擇對(duì)組胺酪胺降解率較高，生物胺產(chǎn)生量較少的菌株進(jìn)行二級(jí)復(fù)篩。

二級(jí)復(fù)篩：使用LB和MMRS液體培養(yǎng)基對(duì)一級(jí)復(fù)篩菌株進(jìn)行活化，并調(diào)節(jié)初始OD值,使其在含100 mg/L生物胺的MMRS培養(yǎng)基中為0.1[16]，并于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。24 h后測定加入菌株的發(fā)酵液中的生物胺含量，并與未添加菌株的發(fā)酵液(空白組)相比，測定生物胺的降解率，選擇降解生物胺種類多且降解率最高的菌株作為生物胺降解菌株。

1.3.3 生物胺降解率測定

含有菌株的緩沖液或發(fā)酵液經(jīng)4 000×g離心5 min得到上清液(發(fā)酵液的上清液需經(jīng)等體積的60 g/L的三氯乙酸溶液處理)，并通過0.22 μm濾膜過濾。取2 mL上清液于10 mL離心管中，相繼加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液和20 μL苯甲酰氯溶液，立即將離心管放入水浴恒溫振蕩器，30 ℃，200 r/min振蕩20 min進(jìn)行衍生反應(yīng)。振蕩結(jié)束后加入2 mL飽和NaCl溶液停止衍生化反應(yīng)，再加入3 mL無水乙醚進(jìn)行生物胺的萃取，使用渦旋振蕩儀萃取1 min，小心吸取上清液置于5 mL離心管中，并通過氮吹儀吹干。加入1 mL乙腈溶解管中殘留物，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測，然后利用高效液相色譜法測定生物胺含量，液相條件參照HWANG等人的研究[17-19]。條件如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program for separation ofbiogenic amines

注：A相是乙酸銨溶液(0.01 mol/L)，B相是乙腈

樣品組(含有菌株的緩沖液或發(fā)酵液)與空白組(不含菌株的緩沖液或發(fā)酵液)對(duì)比，測定生物胺的降解率。降解率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X，生物胺降解率，%；ρ1，不含菌株的樣品生物胺質(zhì)量濃度，mg/L；ρ2，接種菌株的樣品生物胺質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.4 生物胺降解菌株分子鑒定

使用DNA提取試劑盒(GK 1072，上海捷瑞生物工程有限公司)對(duì)生物胺降解菌株進(jìn)行DNA的提取，并通過引物8F-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R-CTACGGCTACCTTGTTACGA對(duì)菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL：12.5 μL ETaq DNA聚合酶，9.5 μL無菌水，上下游引物各1.0 μL，1.0 μL模板DNA。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min, 進(jìn)入以下循環(huán)：94 ℃變性60 s, 56 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過提純?cè)噭┖屑兓?進(jìn)行測序，將得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定菌株的種屬。

1.3.5 生物胺降解菌株降解特性研究

探究乳酸片球菌在不同影響因素(溫度、鹽濃度、pH)下的降解特性以及生長情況[20]。將乳酸片球菌在MMRS培養(yǎng)基中37 ℃活化24 h，4 000×g離心5 min，將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖液中，菌液濃度約為8 lg CFU/mL，作為起始接種物。將其接種在不同條件下的MMRS培養(yǎng)基中，菌液濃度約為6 lg CFU/mL，并在37 ℃下放置24 h后測定生物胺降解率以及活菌數(shù)?；罹鷶?shù)可通過平板計(jì)數(shù)法，即將菌液稀釋涂布于MMRS固體培養(yǎng)基，待生長48 h后即可計(jì)數(shù)。其中溫度梯度設(shè)為20、25、30、35、40、45 ℃；鹽的質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、30、60、90、120、150、180 g/L；pH梯度設(shè)為4、5、6、7、8、9、10。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物胺降解菌株的初篩

從BAs固體培養(yǎng)基中篩選得到25株菌株，由于該培養(yǎng)基以生物胺為唯一氮源，營養(yǎng)不豐富，導(dǎo)致平板上的菌落形態(tài)較為單一，且BAs液體培養(yǎng)基活化菌株生長較慢，故選取LB培養(yǎng)基用來活化BAs固體培養(yǎng)基篩選得到的菌株，命名為L-1～L-25。而MMRS固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)豐富，篩選得到45株菌株，命名為M-1～M-45。

2.2 生物胺降解菌株的復(fù)篩

將初篩菌株接種到含有生物胺的磷酸鹽緩沖液中測定其在該環(huán)境下的生物胺降解率，并將初篩菌株放入含有前體氨基酸的培養(yǎng)基中，研究其生物胺生產(chǎn)能力。表2為菌株對(duì)8種生物胺的降解能力，圖1為菌株對(duì)8種生物胺的降解能力的比較分析。由表2和圖1可知,L開頭的菌株對(duì)酪胺均具有較高的降解能力，最高可達(dá)41.2%。其中L-1、L-2、L-12、L-22、L-25、M-2、M-8、M-9、M-11、M-18、M-19、M-21、M-23、M-27、M-28、M-29、M-32、M-34、M-35、M-42、M-43和M-44對(duì)組胺和酪胺這2種毒性較強(qiáng)的生物胺均有較高的降解率，且最高分別可達(dá)到52.88%和45.33%。這些菌株可能具有較強(qiáng)的組胺氧化酶和酪胺氧化酶活性，可以降解更多的組胺與酪胺。

表2 緩沖液中不同菌株對(duì)8種生物胺降解能力的比較Table 2 Comparison of biogenic amines degradation ability from different strains in buffer

續(xù)表2

菌株降解率/%腐胺尸胺亞精胺精胺色胺苯乙胺組胺酪胺M-2522.19±8.5126.57±8.311.19±31.52NDNDNDND17.5±5.15M-2623.31±15.95ND21.91±24.52ND8.99±0.813.73±0.5234.33±6.07NDM-2715.03±0.037.31±0.028.32±0.021.96±0.130.86±0.040.04±0.0518.9±0.0524.45±0.07M-2813.78±0.318.44±0.256.81±0.176.41±0.288.93±0.364.32±0.1814.10±0.9814.04±0.55M-2922.29±1.73ND8.57±2.05NDNDND47.74±1.0243.18±0.66M-308.21±0.77ND26.64±0.8433.67±0.99NDNDNDNDM-3112.2±0.1910.52±0.15NDNDNDNDND8.65±0.10M-3217.82±0.1617.06±0.156.05±0.140.34±0.141.83±0.004.2±0.0016.05±0.6420.29±0.32M-332.34±0.144.82±0.10NDNDND 4.07±0.12ND2.69±0.21M-346.14±0.92ND1.23±0.98NDNDND19.31±0.0119.37±0.46M-355.87±1.18NDNDND ND ND 15.98±0.5919.22±0.87M-3625.57±0.08ND22.19±1.8611.44±2.88NDND28.03±2.6221.43±2.92M-3734.55±0.535.15±0.6144.92±0.5643.4±0.56NDNDNDNDM-3812.94±1.64ND15.42±2.628.9±3.28NDND23.06±1.151.54±1.92M-3910.36±1.015.73±0.705.12±0.683.55±0.680.82±0.125.65±0.02ND42.05±0.03M-4013.16±1.520.89±0.5615.73±1.7116.98±1.19NDND33.99±0.5523.79±0.22M-4114.54±1.7213.76±1.962.13±1.69ND1.08±0.332.11±0.427.97±1.0820.36±0.84M-4219.6±0.83ND20.18±1.7216.63±1.70NDND24.1±0.2515.31±1.14M-431.11±0.66ND NDND ND ND 35.83±0.952.39±2.03M-4416.98±0.2417.01±0.382.97±0.25ND5.9±0.365.88±0.2011.32±0.9318.29±0.26M-4523.39±1.4421.44±1.7311.37±1.483.08±1.47ND0.15±0.6425.11±1.1227.68±0.55

注：ND表示未檢測到(下同)

圖1 緩沖液中不同菌株對(duì)8種生物胺降解能力的比較Fig.1 Comparison of biogenic amines degradation ability from different strains in buffer

由于某些具有生物胺降解能力的菌株可能含有氨基酸脫羧酶，將前體氨基酸轉(zhuǎn)換生成生物胺[21]，因此，進(jìn)一步分析了菌株生產(chǎn)生物胺的能力。表3為菌株的生物胺生產(chǎn)能力，圖2為菌株產(chǎn)生生物胺能力的比較分析。由表3和圖2可知，菌株M-19、M-21、M-23對(duì)酪胺產(chǎn)生能力較強(qiáng)，最高可達(dá)到150.05 mg/L，這3株菌可能具有較高的酪氨酸脫羧酶活性。菌株M-32對(duì)8種生物胺均不具有產(chǎn)生能力。綜合分析，菌株L-1、L-2、L-12、L-22、L-25、M-9、M-11、M-18、M-27、M-28、M-29、M-32、M-34、M-35、M-42、M-43和M-44對(duì)組胺和酪胺均有較高的降解率，且產(chǎn)生物胺能力較弱，于是選擇這17株菌進(jìn)行二級(jí)復(fù)篩。這17株菌株的胺氧化酶活性高于胺脫羧酶活性。

表3 不同菌株對(duì)8種生物胺產(chǎn)生能力的比較Table 3 Comparison of biogenic amines producing ability from different strains

續(xù)表3

菌株生物胺產(chǎn)生量/(mg·L-1)腐胺尸胺亞精胺精胺色胺苯乙胺組胺酪胺L-7NDND0.25±0.06ND2.02±0.530.41±0.50NDNDL-80.01±0.06ND0.70±0.09ND1.46±0.040.62±0.49ND0.59±0.66L-90.09±0.09ND0.37±0.22ND1.32±0.31NDND4.81±0.39L-10NDND0.06±0.33ND0.85±0.11NDND0.52±0.60L-110.16±0.19ND0.47±0.19ND1.40±0.10NDNDNDL-120.01±0.08ND0.18±0.24ND0.84±0.11NDND0.39±0L-130.24±0.02ND1.19±0.22ND1.18±0.29ND0.49±0.291.87±1.62L-140.92±0.15ND1.12±0.06ND1.21±0.02NDND2.37±1.14L-150.55±0.67ND0.37±0.32ND1.21±0.07NDND2.65±1.05L-160.14±0ND0.20±0.56ND1.16±0.12ND0.96±0.89NDL-170.58±0.03ND0.71±0.36ND1.36±0.16NDND0.01±0.30L-180.49±0ND0.51±0.02ND1.36±0.07NDNDNDL-190.37±0.02ND0.79±0.43ND1.53±0.470.54±0.15ND0.40±0.35L-20NDND0.34±0.25ND0.99±0.070.09±0.08ND1.12±0.34L-210.16±0.03ND0.91±0ND1.21±0.090.11±0.34ND0.12±0.03L-22NDNDNDND0.84±0.12NDND0.07±0L-230.76±0.05ND0.68±0.29ND1.59±0NDND3.24±0.63L-240.36±0.07ND0.56±0.30ND1.50±0NDNDNDL-250.49±0.03ND0.44±0.14ND1.23±0.11NDND0.01±0.24M-10.15±0.180.1±0.192.17±1.32ND0.37±0.051.23±0.031.33±0.18NDM-2ND0.35±0.812.13±3.661.23±2.490.24±0.120.17±0.380.36±0.88NDM-30.11±0.04ND1.41±0.10ND0.35±0.150.69±0.090.64±0.60NDM-4ND0.14±0.013.49±0.64ND0.34±0.190.99±1.452.39±0.58NDM-50.14±0.05ND3.62±1.12ND0.69±0.221.03±0.151.02±0.07NDM-60.06±0.02ND2.71±0.50ND0.41±0.031.09±0.481.41±1.24NDM-7NDND2.75±1.08ND0.54±0.290.62±0.030.76±0.42NDM-80.56±0.050.74±0.275.79±1.1ND1.12±0.450.39±0.31NDNDM-9NDND6.78±0.19NDND0.21±0.152.58±0.25NDM-100.01±0.16ND8.14±0.22ND0.22±0.40.16±0.242.47±0.17NDM-11NDND3.43±0.16ND0.69±0.18NDNDNDM-120.04±0.03ND8.60±0.85ND0.55±0.260.31±0.072.48±0NDM-130.04±0.200.03±06.27±3.1ND0.29±0.161.21±0.60.88±0.2NDM-14ND0.07±0.021.65±0.45ND0.44±0.020.28±02.61±0.12NDM-15NDND14.76±7.73ND0.16±0.160.10±0.132.12±0NDM-16ND0.01±0.064.96±1.50ND0.82±0.040.27±0.141.12±0.17NDM-17NDND6.45±0.35ND0.38±0.050.62±0.271.81±0.39NDM-18NDND1.90±0.27NDND0.12±0.050.25±0.09NDM-19NDND2.97±0.07NDND2.70±0.180.74±0.04104.46±9.43M-200.05±0.241.07±0.14.67±0.30ND0.42±0.081.33±0.12NDNDM-21NDND3.11±1.23NDND68.13±00.63±0.06150.05±8.16M-22NDND2.40±1.58ND0.17±0.030.40±0.270.37±0.27NDM-23ND0.23±1.113.21±0.650.08±3.98ND2.49±0.080.37±0.32119.58±16.19M-24ND0.16±0.244.01±0.36ND0.60±0.020.25±0.310.96±1.32NDM-25NDND1.74±0.08ND0.47±0.260.27±0.082.21±1.70NDM-26NDND3.93±0.18ND0.37±0.280.59±0.062.34±0.82NDM-27NDND2.82±0.02ND0.6±0.13ND0.82±0.01NDM-28NDND2.20±0.95ND0.37±0.35ND0.24±0.29NDM-29NDND2.17±0.32ND0.59±0ND1.50±0.01NDM-30ND0.41±0.544.49±0.64ND4.98±0.0330.5±3.11NDNDM-310.28±0.04ND6.75±0.29ND0.31±0.210.22±0.512.75±0.49NDM-32NDNDNDNDNDND0.07±1.13NDM-33NDND14.25±1.98ND0.29±0.121.47±0.112.88±0.394.90±2.25M-34NDND8.85±7.70NDND0.34±0.330.18±0.32ND

續(xù)表3

菌株生物胺產(chǎn)生量/(mg·L-1)腐胺尸胺亞精胺精胺色胺苯乙胺組胺酪胺M-35NDND1.84±0.16ND0.23±0.04ND1.09±0.19NDM-36NDND3.82±1.00ND0.27±0.010.20±0.080.79±0.39NDM-37NDND6.36±8.850.4±0.530.06±0.280.67±0.612.27±0NDM-380.27±0.10NDNDND0.65±0.201.29±0.16NDNDM-39NDND2.04±2.15ND8.18±0.1640.50±2.830.98±0NDM-400.09±0.110.43±0.3211.43±2.031.09±0.440.26±0.150.44±0.062.35±1.19NDM-410.07±0.54ND8.92±7.43ND0.48±0.060.61±0.540.72±0.15NDM-42NDND2.96±2.60ND0.56±0.02ND1.04±0NDM-43NDND2.06±0.46ND0.70±0.30ND0.11±0.10NDM-44ND0.26±0.181.65±2.480.45±0.15ND0.19±0.03NDNDM-45ND0.02±0.124.39±2.300.02±0.27ND0.18±01.00±0.20ND

圖2 不同菌株對(duì)8種生物胺產(chǎn)生能力的比較Fig.2 Comparison of biogenic amines producing ability from different strains

2.3 生物胺降解菌株的二級(jí)篩選

由表4可知，菌株M-28與M-18對(duì)8種生物胺均能降解，對(duì)酪胺降解能力相差不大，其中M-28菌株對(duì)組胺降解能力更強(qiáng)，因此選擇M-28作為最終的生物胺降解菌株，其在發(fā)酵液中對(duì)腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、色胺、苯乙胺、組胺和酪胺的降解率分別為(11.32±0.61)%、(6.97±1.19)%、(2.10±0.80)%、(10.57±0.57)%、(3.68±0.17)%、(1.75±3.83)%、(42.18±4.25)%和(5.80±0.81)%。

研究結(jié)果表明，在磷酸鹽緩沖液中生物胺降解率較高的菌株，在發(fā)酵液中降解率不一定高，如菌株M-29?？赡苡捎诹姿猁}緩沖液中無其他氮源，菌株只能被迫消耗生物胺。而在發(fā)酵液中，營養(yǎng)豐富，某些菌株可能優(yōu)先利用其他氮源。所以經(jīng)二級(jí)復(fù)篩后的菌株M-28是能夠在營養(yǎng)充足的環(huán)境中優(yōu)先利用生物胺的菌株，也更能有效地應(yīng)用于環(huán)境復(fù)雜、營養(yǎng)豐富的醬中。

表4 發(fā)酵液中不同菌株對(duì)8種生物胺降解能力的比較Table 4 Comparison of biogenic amines degradation ability from different strains in fermentation broth

2.4 生物胺降解菌株的分子鑒定及生長曲線

通過PCR方法獲得M-28菌株的16S rDNA序列，并測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI上的BLAST比對(duì)，可知M-28菌株與Pediococcusacidilacticistrain ATCC 8042菌株(GenBank accession no. CP033438.1)相似度達(dá)到100%，因此認(rèn)定其為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。有研究顯示，韓國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中分離出的乳酸片球菌具有降解組胺和酪胺的作用，降解率分別為14.7%～23.7%和15.7%～25.9%[22]，與該研究結(jié)果相比，本研究篩選出的乳酸片球菌M-28可以降解8種生物胺，且組胺降解率更高。

通過測定M-28乳酸片球菌在MRS培養(yǎng)基中24 h內(nèi)的OD值，可得到乳酸片球菌M-28的生長曲線。由圖3可知，乳酸片球菌從第4h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，大約到16 h時(shí)，生長趨于穩(wěn)定。

圖3 乳酸片球菌生長曲線Fig.3 Growth curve of P. acidilactici M-28

2.5 生物胺降解菌株的降解特性

乳酸片球菌M-28在不同鹽濃度、溫度與pH條件下的組胺、酪胺降解率及活菌數(shù)如表5、表6和表7所示。

表5 不同鹽含量下乳酸片球菌降解特性及生長情況分析Table 5 Analysis on degradation characteristics and growth of P. lactis at different salt concentration

由表5可知,菌株鹽的質(zhì)量濃度為0～90 g/L時(shí)生長良好，對(duì)組胺和酪胺均有較高的降解率，最高分別可達(dá)到89.02% 和31.49%。當(dāng)鹽質(zhì)量濃度>120 g/L時(shí)，降解率明顯下降。可能由于菌株的生長受到了抑制，活菌數(shù)減少，與生物胺降解相關(guān)的胺氧化酶分泌較少，導(dǎo)致生物胺降解率低于低鹽環(huán)境。

由表6可知,乳酸片球菌M-28在溫度為30～40℃時(shí)，菌株生長較好且在30 ℃時(shí)對(duì)組胺和酪胺降解率最高,分別為65.51%和28.06%。而在溫度為20或45 ℃時(shí)，菌株不適應(yīng)相對(duì)低溫或相對(duì)高溫下的環(huán)境，活菌數(shù)降低，胺氧化酶數(shù)量減少，且菌株的生物胺氧化酶在低溫時(shí)活性降低，在溫度高時(shí)會(huì)失活，從而導(dǎo)致降解率較低。有研究證明組胺氧化酶活性在30 ℃時(shí)最高，在25 ℃時(shí)活性降低，在45 ℃時(shí)酶活力幾乎為零[20]。

表6 不同溫度下乳酸片球菌降解特性及生長情況分析Table 6 Analysis on degradation characteristics and growth of P. lactis at different temperature

由表7可知,乳酸片球菌M-28可耐受pH 4～9的環(huán)境，在該pH范圍內(nèi)均可生長。在pH 4～8時(shí)，均對(duì)組胺酪胺有一定的降解。當(dāng)pH為6時(shí)，對(duì)組胺和酪胺降解率最高分別為62.73%和23.78%。而當(dāng)pH 9～10時(shí)，降解受到抑制甚至無降解，由于菌株在堿性較高的環(huán)境下生長受到抑制，或者在堿性環(huán)境中生物胺氧化酶的酶活較低[20]，從而無法有效發(fā)揮降解作用。

表7 不同pH下乳酸片球菌降解特性及生長情況分析Table 7 Analysis on degradation characteristics and growth of P. lactis at different pH

3 結(jié)論

本研究通過BAs固體培養(yǎng)基及改良MRS培養(yǎng)基初步篩選得到共70株菌株。經(jīng)過復(fù)篩最終選擇乳酸片球菌M-28作為生物胺降解菌株，其為革蘭氏陽性菌，呈過氧化氫酶和氧化酶陰性，可產(chǎn)生D-或L-乳酸[23]，常作為食品發(fā)酵中的益生菌。通過測定生長曲線可知，該菌在4～16 h屬于對(duì)數(shù)生長期，生長較快。

研究發(fā)現(xiàn)，菌株的生長與降解特性具有一定的相關(guān)性。菌落數(shù)多，降解率相對(duì)較高。乳酸片球菌在溫度30～40 ℃，鹽的質(zhì)量濃度為0～90 g/L，pH 5～8時(shí)菌落數(shù)約8 lg CFU/mL左右，對(duì)組胺或酪胺的降解率最高，達(dá)(89.01±0.7)%和(31.48±6.41)%。傳統(tǒng)發(fā)酵食品如豆醬、醬油或腐乳中生物胺的存在可能令產(chǎn)品的質(zhì)量下降，甚至引起消費(fèi)者的各種過敏反應(yīng)。豆醬的pH一般為5左右，鹽含量約10%, 夏季發(fā)酵溫度約為30 ℃。該菌株可適應(yīng)豆醬的發(fā)酵環(huán)境，應(yīng)用于豆醬發(fā)酵過程中的生物胺含量的控制，由于可耐150 g/L鹽，對(duì)其他高鹽發(fā)酵食品也具有良好的應(yīng)用前景[2]。