糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷與線粒體Lon蛋白酶水平的關(guān)系

王文杰,楊文曲,韓沖芳,賀建東,李浩甲,任鵬鵬(山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院麻醉教研室,太原 03000;山西白求恩醫(yī)院,山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院麻醉科;通訊作者,E-mail:hanchongfang003@foxmail.com)

糖尿病是心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,糖尿病患者圍術(shù)期心血管事件的發(fā)生率增加。研究表明,在心肌缺血再灌注過程中,糖尿病因素會(huì)加重心肌損傷[1]。而線粒體氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中均起到了重要作用[2]。線粒體Lon蛋白酶(LonP1)作為線粒體基質(zhì)內(nèi)主要的氧化蛋白酶,在線粒體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的過程中具有重要作用[3]。糖尿病因素加重心肌缺血再灌注損傷是否與LonP1含量有關(guān)尚不清楚。本研究擬評(píng)價(jià)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時(shí)LonP1含量的變化,為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

清潔健康雄性SD大鼠40只,2-3月齡,體質(zhì)量200-250 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組(n=10):假手術(shù)組(sham組)、心肌缺血再灌注組(I/R組)、糖尿病+假手術(shù)組(DM+sham組)、糖尿病+缺血再灌注組(DM+I/R組)。

1.2 糖尿病大鼠模型建立

參考文獻(xiàn)[4]制備大鼠糖尿病模型。DM+sham組與DM+I/R組在普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周并禁食12 h后,腹腔注射1%鏈脲佐菌素60 mg/kg,24 h后尾靜脈采血測定空腹血糖。繼續(xù)喂養(yǎng)4周,以持續(xù)空腹血糖≥16.7 mmol/L,并出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿以及體質(zhì)量下降等表現(xiàn)為大鼠Ⅰ型糖尿病模型制備成功。sham組和I/R組腹腔注射等容量枸櫞酸鈉/枸櫞酸緩沖液(0.1 mmol/L,pH值4.2),并同步適應(yīng)性喂養(yǎng)。淘汰死亡及模型建立失敗的大鼠并補(bǔ)充樣本量,維持樣本量為每組10只。

1.3 心肌缺血再灌注模型建立

參考文獻(xiàn)[5]制備大鼠心肌缺血再灌注模型。大鼠術(shù)前禁食12 h,腹腔注射1%戊巴比妥75 mg/kg實(shí)施麻醉后,仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,針狀電極連續(xù)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。取頸部正中切口行氣管切開氣管插管術(shù),連接ALC-V8型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾特生物科技有限公司)行機(jī)械通氣,潮氣量2.5 ml/100 g,通氣頻率60次/min,吸呼比1∶2。行右側(cè)頸總動(dòng)脈穿刺置管術(shù),連接BL-410型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)監(jiān)測心率和血壓。于胸骨左緣3、4肋間開胸,打開心包暴露心臟,I/R組和DM+I/R組用6-0絲線于左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),心電圖示ST段抬高、T波高聳,表明心肌缺血成功。30 min后松開止血鉗,復(fù)灌心肌,并持續(xù)120 min,心電圖示ST段明顯下降,表明心肌再灌注成功。sham組和DM+sham組僅穿線,不結(jié)扎LAD。

1.4 血清cTnI濃度檢測

于再灌注120 min時(shí),每組取5只大鼠,經(jīng)頸動(dòng)脈采血2 ml,靜置2 min后以3 500 r/min離心5 min,離心半徑10 cm,取上層血清,分裝并存放于-80 ℃冰箱,后采用AU640全自動(dòng)生化儀(美國MD公司)檢測血清cTnI濃度。

1.5 TTC染色法測定心肌梗死范圍

于再灌注120 min時(shí),每組取5只大鼠,重新結(jié)扎LAD,經(jīng)頸動(dòng)脈逆行注射0.5%伊文氏藍(lán)3 ml,立即處死大鼠剪下心臟,經(jīng)生理鹽水沖洗后,置于-20 ℃冰箱中20 min,垂直于心臟長軸連續(xù)切片,切片厚度2-3 mm,置入0.5%氯化三苯基四氮唑磷酸緩沖液中孵育。紅色區(qū)域?yàn)槿毖垂Ｋ佬募?灰白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ佬募?藍(lán)色區(qū)域?yàn)闉槿毖募?。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)分析梗死心肌占缺血心肌面積的百分比,即心肌梗死范圍。

1.6 HE染色觀察病理切片

于再灌注120 min時(shí),取每組剩余5只大鼠,將結(jié)扎部位以下缺血區(qū)的心肌組織分成3份。取部分組織行HE染色,經(jīng)甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟后,于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)結(jié)果。

1.7 LonP1水平檢測

取部分缺血區(qū)組織采用Western blot法測定心肌組織LonP1的表達(dá)水平。按照蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明,將大鼠心臟組織加入細(xì)胞裂解液中,勻漿后離心取上清液。BCA法測定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量,根據(jù)目的蛋白的分子量配制分離膠與濃縮膠,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、漂洗、封閉后,加入兔抗鼠單克隆LonP1抗體(1∶1 000,ABclonal公司),4 ℃孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶1 000,ABclonal公司)二抗,室溫孵育2 h后TBST漂洗5 min×3次。在暗室中曝光,并用圖像分析軟件分析測定條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,以LonP1條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值之比反映LonP1的表達(dá)水平。

1.8 線粒體順烏頭酸酶(mt-ACO2)活性檢測

取部分缺血區(qū)組織采用分光光度法測定心肌組織mt-ACO2活性。按照順烏頭酸酶活性檢測試劑盒(上海齊一生物科技有限公司)說明,將大鼠心肌組織加入細(xì)胞裂解液,勻漿后離心,取沉淀加入線粒體裂解液,超聲波破碎后取樣本液于石英比色皿中,加入測定液,使用分光光度計(jì)測定340 nm處20 s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和200 s后的吸光值A(chǔ)2,按照說明書中的標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算mt-ACO2活性,具體計(jì)算公式如下:

mt-ACO2[nmol/(min·g)]=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=54×ΔA÷W

其中,V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4L;ε:NADH的摩爾消光系數(shù),6.22×103L/(mol·cm);d:比色皿光徑,1 cm;V樣:加入樣本體積,0.04 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應(yīng)時(shí)間,3 min;W:樣本質(zhì)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死范圍與血清cTnI含量

與sham組比較,DM+sham組心肌梗死范圍和血清cTnI含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而I/R組和DM+I/R組心肌梗死范圍增大,血清cTnI含量升高(P<0.05);與I/R組比較,DM+I/R組心肌梗死范圍增大,血清cTnI含量升高(P<0.05);與DM+sham組比較,DM+I/R組心肌梗死范圍增大,血清cTnI含量升高(P<0.05,見表1)。

2.2 心肌LonP1水平

與sham組比較,I/R組、DM+sham組和DM+I/R組心肌LonP1水平升高(P<0.05);與I/R組比較,DM+I/R組心肌LonP1水平降低(P<0.05);與DM+sham組比較,DM+I/R組心肌LonP1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1,圖1)。

2.3 心肌mt-ACO2活性

與sham組比較,DM+sham組心肌mt-ACO2活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),I/R組和DM+I/R組心肌mt-ACO2活性降低(P<0.05);與I/R組比較,DM+I/R組心肌mt-ACO2活性降低(P<0.05);與DM+sham組比較,DM+I/R組心肌mt-ACO2活性降低(P<0.05,見表1)。

表1 四組大鼠心肌梗死范圍、cTnI含量、LonP1水平及順烏頭酸酶活性的比較 (n=5)Table 1 Comparison of myocardial infarction range, cTnI content, LonP1 level and ACO2 activity among four groups (n=5)

與sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與DM+sham組比較，&P<0.05

圖1 四組大鼠心肌組織LonP1 Western blot檢測條帶Figure 1 LonP1 expression in cardiac tissues of rats in four groups by Western blot

2.4 心肌病理染色

光鏡下可見,sham組心肌細(xì)胞形態(tài)正常,胞質(zhì)染色均勻,纖維排列整齊,胞核居中,結(jié)構(gòu)完整;DM+sham組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,心肌纖維排列稍紊亂,胞漿有輕度的腫脹;I/R組心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,胞漿有不同程度的腫脹甚至破裂,胞核排列不齊、碎裂;DM+I/R組損傷程度較I/R組增強(qiáng),心肌纖維斷裂,心肌細(xì)胞大量崩解,細(xì)胞核溶解,染色加深(見圖2)。

圖2 四組大鼠心肌組織病理切片HE染色 (×400)Figure 2 HE staining of myocardial histopathological sections in four groups (×400)

3 討論

本研究參考文獻(xiàn)[4],采用禁食12 h后,腹腔注射1%鏈脲佐菌素60 mg/kg的方法制備大鼠糖尿病模型,給藥24 h后尾靜脈采血測定空腹血糖,并繼續(xù)喂養(yǎng)4周,持續(xù)空腹血糖≥16.7 mmol/L,并出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿以及體質(zhì)量下降等表現(xiàn),提示大鼠糖尿病模型制備成功。同時(shí)參考文獻(xiàn)[5]制備大鼠心肌缺血再灌注模型。結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),心電圖示ST段抬高、T波高聳,結(jié)扎區(qū)域心肌顏色蒼白,TTC染色提示心肌梗死面積增大,病理學(xué)顯示損傷加重,提示心肌缺血模型制備成功。

線粒體是細(xì)胞代謝的重要組成部分,線粒體穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)胞存活至關(guān)重要。在心肌缺血再灌注損傷過程中,由于線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)軗p以及抗氧化能力下降,線粒體活性氧物質(zhì)(mtROS)大量產(chǎn)生[6],導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙、脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷,進(jìn)而引起線粒體去極化、Ca2+超載、能量代謝障礙,甚至細(xì)胞死亡。mt-ACO2是一種鐵硫蛋白酶,定位于線粒體的順烏頭酸酶參與三羧酸循環(huán),催化細(xì)胞內(nèi)檸檬酸經(jīng)過中間產(chǎn)物順烏頭酸生成異檸檬酸。鐵硫簇[4Fe-4S]2+是酶促反應(yīng)的活性中心。鐵硫簇中包含4個(gè)Fe2+,由于Fe2+較易氧化為Fe3+,當(dāng)細(xì)胞中ROS產(chǎn)生增加時(shí),會(huì)導(dǎo)致[4Fe-4S]2+氧化從而失去Fe2+變成[3Fe-4S]+,使mt-ACO2失去活性,所以mt-ACO2活性常被用于指示線粒體氧化應(yīng)激水平[7]。本研究結(jié)果表明,與sham組相比,I/R組mt-ACO2活性降低,心肌梗死范圍與cTnI含量上升,提示心肌缺血再灌注損傷與線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激加重有關(guān)。與I/R組相比,DM+I/R組mt-ACO2活性降低,心肌梗死范圍與cTnI含量上升,提示糖尿病加重大鼠缺血再灌注損傷,且與線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)。

LonP1是一種在進(jìn)化過程中高度保守的ATP依賴性絲氨酸蛋白酶,定位于線粒體基質(zhì),它負(fù)責(zé)降解線粒體基質(zhì)內(nèi)被氧化修飾、功能失調(diào)或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì),被氧化的mt-ACO2就是其主要底物之一。mt-ACO2的氧化過程不僅會(huì)使其活性下降,降低線粒體能量產(chǎn)出,同時(shí)還會(huì)釋放游離鐵[8],而細(xì)胞內(nèi)游離鐵含量的增加可通過鐵死亡通路介導(dǎo)鐵依賴性脂質(zhì)過氧化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9]。除此之外,LonP1通過降解氧化呼吸鏈中復(fù)合體Ⅰ的ROS生成域,降低復(fù)合體Ⅰ的活性,減少去極化線粒體中ROS的生成,從而在一定程度上緩解線粒體所遭受的氧化應(yīng)激[10]。已有研究證實(shí),熱休克[11]、血清饑餓和氧化應(yīng)激[12,13]等均可以誘導(dǎo)細(xì)胞LonP1水平上調(diào)。本研究結(jié)果表明,與sham組相比,I/R組LonP1顯著增多,提示缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)LonP1水平上調(diào)。DM+sham組LonP1水平高于sham組,但卻低于I/R組,顯示糖尿病也可以誘導(dǎo)LonP1水平上調(diào),但其誘導(dǎo)能力明顯低于缺血再灌注損傷。值得注意的是,與DM+sham組相比,DM+I/R組LonP1水平并未見明顯升高,同時(shí)mt-ACO2活性降低,心肌損傷加重,顯示在糖尿病背景下,雖然LonP1基礎(chǔ)水平有所提高,但急性應(yīng)激壓力對(duì)LonP1的誘導(dǎo)能力卻消失。由于LonP1在線粒體基質(zhì)氧化蛋白質(zhì)的降解途徑中發(fā)揮重要作用,因此這種LonP1誘導(dǎo)能力的喪失可能使包括mt-ACO2在內(nèi)的多種線粒體蛋白質(zhì)在氧化修飾后降解受阻而大量積累,加重線粒體氧化應(yīng)激壓力,進(jìn)而加重細(xì)胞損傷。

綜上所述,糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷加重可能與糖尿病背景下缺血再灌注損傷針對(duì)LonP1的急性誘導(dǎo)能力喪失有關(guān)。