靶向HER-2多模態(tài)納米探針的制備及性能研究

安改麗,劉 屹,喻 鳳,陳小龍,郭 維(陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 70068;陜西省人民醫(yī)院影像科;陜西省人民醫(yī)院教學(xué)科;通訊作者,E-mail:viking6@6.com)

文獻中已有學(xué)者設(shè)計合成了HER2靶向探針,用于不同成像模式下HER2陽性腫瘤的成像,包括使用不同的放射性標(biāo)記物(18F、89Zr、68Ga)進行PET顯像[5-8],用SPIO顆粒進行MRI顯像[9,10]。也有學(xué)者設(shè)計了多模態(tài)分子探針用于顯示EGFR陽性腫瘤[10,11],檢測腫瘤血管生成[12-14],或評價抗癌藥物運送效率[12],但迄今為止,適用于HER2陽性乳腺癌PET-CT/MRI顯像的多模態(tài)探針尚未見報道。本研究在文獻基礎(chǔ)上,擬合成多模態(tài)HER2靶向探針,使其能夠應(yīng)用于PET-CT及MRI兩種影像學(xué)模式,使腫瘤細胞表面HER2受體特異性顯影,達到無創(chuàng)檢測HER2的目的,使HER2陽性乳腺癌能夠被早期、快速、特異性地診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株SK-BR3(購自上海生科院細胞資源中心);超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)(中科雷鳴北京有限公司);PAA(美國Sigma公司);Herceptin(羅氏制藥有限公司);噻唑蘭(MTT,美國Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO,上海浩然生物技術(shù)有限公司);4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司);RPMI-1640(美國GIBCO公司);胎牛血清(美國GIBCO公司)。

1.2 多模態(tài)HER2納米靶向探針的制備

1.2.1 SPIO-Herceptin的制備 參照文獻[10,11],使用高熱分解法合成生物相容性SPIO,并用聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)對其進行表面功能化修飾,過程如下:

稱取NaOH于100 ml三口瓶中,加入20 ml三乙二醇。磁力攪拌,通氬氣(Ar2)15 min后,加熱到120 ℃并保持10 min,然后將溫度保持在70 ℃待用。取適量PAA和FeCl3于100 ml三口瓶中,加入20 ml三乙二醇。在機械攪拌的條件下通Ar215 min,加熱升溫至220 ℃,然后加入4 ml NaOH溶液,反應(yīng)1 h后,冷卻至室溫。通過乙醇洗滌和磁分離進行提純,真空干燥,得到SPIO-PAA。將SPIO-PAA與Herceptin進行化學(xué)偶聯(lián),合成SPIO-Herceptin,分裝于EP管內(nèi),4 ℃保存。

1.2.2 SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F的制備 參照文獻[10,11],將適量p-SCN-Bn-NOTA加入到SPIO-Herceptin溶液中,室溫反應(yīng)10 h,通過水洗滌和磁分離進行提純,得到SPIO-Herceptin-NOTA。將2 mmol/L AlCl3和2 mmol/L K18F溶液混合,將SPIO-Herceptin-NOTA加入到上述溶液中,37 ℃孵化30 min,通過水洗滌和磁分離進行提純,得到SPIO-herceptin-NOTA-AI18F。PBS緩沖液對所提純物進行洗脫,每0.5 ml洗脫液收集1管,共20管。同法制備不含SPIO微球的Herceptin-NOTA-AI18F作對照。PBS設(shè)定為空白對照。

1.3 SPIO-PAA的一般特征檢測

1.3.1 理化性質(zhì)檢測 使用超純水溶解制備好的SPIO-PAA,目測法來觀察其溶液顏色及透明度,取適量樣品并使用標(biāo)準(zhǔn)pH試紙測定pH值。

1.3.2 透射電鏡檢測形態(tài) 取適量SPIO-PAA并充分研磨,使用乙醇作為分散劑,超聲分散后取2 μl懸浮液滴于銅網(wǎng)上,自然干燥后通過高分辨透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒的大小及形態(tài)。

1.3.3 動態(tài)光散射儀檢測 分別取1%SPIO-PAA及SPIO-herceptin-NOTA-AI18F水溶液,加入石英比色皿中,在波長633 nm的He/Ne激光下對樣品進行掃描測定。

1.3.4 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F磁性分析 取10 μg SPIO-herceptin-NOTA-AI18F裝入長約7 mm的棉簽管中,兩端封口后于振動樣品磁強記樣倉中逐步增加磁場強度,觀察磁化曲線,記錄數(shù)據(jù),計算磁飽和強度和剩磁。

1.3.5 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F脂水分配系數(shù)測定 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的親水性程度采用脂水分配系數(shù)來評估。分別取0.5 ml的正辛醇和PBS緩沖液,充分混勻,取10 μl SPIO-herceptin-NOTA-AI18F加入裝有上述混合液的EP管中,室溫下振蕩3-5 min,1 500 r/min離心5 min。分別在上(有機相,正辛醇)下(水相,PBS)相中各取0.1 ml作為一個樣品,共3個樣品。放射性活度通過全自動γ放射免疫計數(shù)儀來測定,另取空管進行背景值計數(shù),計算脂水分配系數(shù)。

1.3.6 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F體外穩(wěn)定性試驗 在裝有100 μl PBS的EP管中加入新鮮制備的SPIO-herceptin-NOTA-AI18F溶液,置于37 ℃冰箱中,分別于1,2,3,4 h后取出,Radio-TLC法測定其放射化學(xué)純度,評估其在PBS中的穩(wěn)定性。同法操作流程評估其在胎牛血清中的穩(wěn)定性。

1.4 細胞培養(yǎng)及荷瘤小鼠模型構(gòu)建

人乳腺癌細胞SK-BR3在添加10%胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。選取雌性無胸腺裸鼠16只,4-6周齡,體質(zhì)量在20 g左右,分為實驗組(HER2陽性)和對照組(HER2陰性),每組8只,依次編號和標(biāo)記;無菌條件下,取含有SK-BR3細胞的細胞懸液100 μl(含3×106個細胞)分別接種于實驗組每只裸鼠右前肢背側(cè)皮下,接種1周后用于后續(xù)動物實驗。

1.5 MTT法檢測納米顆粒對細胞增殖的影響

將SPIO-herceptin-NOTA-AI18F納米顆粒配制為如下濃度:200.0,100.0,50.0,25.0,12.5,6.25,3.2 mg/L,加入含SK-BR3細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,后加入MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入100 μl DMSO,酶標(biāo)儀測定吸光度值(A),陰性對照組單純加入培養(yǎng)液,分別計算細胞相對增殖率(RGR)。

1.6 體外細胞特異性結(jié)合實驗

選對數(shù)生長期的SK-BR3細胞,設(shè)置4個時間點組(30 min,1 h,2 h和4 h),每組在EP管中裝有400 μl含有1%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液及計數(shù)為2×105個SK-BR3乳腺癌細胞。每管中加入SPIO-herceptin-NOTA-AI18F溶液50 μl。震蕩1 min,37 ℃水浴箱中培養(yǎng)。分別在預(yù)設(shè)的4個時間節(jié)點取出相應(yīng)的細胞培養(yǎng)管,加入500 μl預(yù)冷的PBS,800 r/min離心5 min,棄上清,PBS洗滌兩遍,γ計數(shù)儀測量每管的放射性計數(shù),計算不同時間點的細胞結(jié)合率,細胞結(jié)合率=(反應(yīng)管計數(shù)-本底計數(shù))/標(biāo)準(zhǔn)管計數(shù)×100%。

1.7 荷瘤鼠的體內(nèi)分布

荷瘤鼠尾靜脈注射一定劑量SPIO-herceptin-NOTA-AI18F,4 h后取血,斷頸處死。取適量腫瘤組織、肺、心臟、肝、胃、脾臟、腸管、腎、股骨、肌肉,生理鹽水清洗干凈后稱重,衰減校正后分別計算各個標(biāo)本單位組織中放射性計數(shù)與注入總放射性計數(shù)的比例(%ID/g)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPIO-PAA和SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的形態(tài)及物理性質(zhì)

本研究成功構(gòu)建靶向HER-2的多模態(tài)納米分子探針,合成的SPIO-PAA可溶于超純凈水中,pH值約為6.5。高分辨透射電子顯微鏡(TEM)下觀察到該納米顆粒大小均一,分散性良好,隨機選取100個SPIO-PAA顆粒并計算其核心粒徑,繪制如下直方圖,該納米顆粒的核心粒徑集中于14-16 nm(見圖1)。動態(tài)光散儀測得的SPIO-PAA及SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的平均水合徑粒分別為46.8 nm和54.35 nm(見圖2)。

圖1 TEM所示SPIO-PAA顆粒粒徑分布圖Figure 1 The particle size distribution of SPIO-PAA by TEM

圖2 動態(tài)光散射儀結(jié)果Figure 2 The average hydrodynamic sizes of SPIO-PAA and SPIO-herceptin-NOTA-AI18F measured by dynamic optical dispersive instrument

2.2 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F納米顆粒的磁性分析

外加磁場為0時,測試的納米顆粒幾乎沒有剩磁,隨著外部磁場強度的不斷增大,其磁化強度也不斷增大;當(dāng)外加磁場強度達到1 800 Oe時,納米顆粒的磁化強度增速趨于平緩,逐漸達到飽和狀態(tài)(見圖3)。經(jīng)測試,SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的飽和磁化強度為50.38 emu/g,與文獻報道的結(jié)果相近,說明該材料具有超順磁性,具備成為MRI顯影劑的潛力。

圖3 SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F的磁滯回曲線Figure 3 The saturation magnetization of SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F

2.3 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F脂水分配系數(shù)測定

經(jīng)計算,SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F的LogP=log[(正辛醇相γ計數(shù)-背景平均γ計數(shù))/(PBS相γ計數(shù)-背景平均γ計數(shù))]=-2.58±0.21(見表1),說明此探針呈現(xiàn)明顯的親水性。

表1 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F的脂水分配系數(shù)Table 1 Fat water distribution coefficient of SPIO-herceptin-NOTA-AI18F

2.4 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F體外穩(wěn)定性分析

在恒溫條件下(37 ℃),SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在PBS緩沖液中孵育4 h放化純度在75%左右,在胎牛血清中孵育4 h放化純度在80%左右(見圖4),說明SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在體外孵育4 h基本是穩(wěn)定存在的。其中,PBS緩沖液是模擬活體內(nèi)堿性微環(huán)境,胎牛血清是模擬活體內(nèi)的血液環(huán)境。

圖4 SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F在PBS及胎牛血清中的穩(wěn)定性Figure 4 The stability of SPIO-Herceptin-NOTA-AI18F in PBS and fetal bovine serum

2.5 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F對SK-BR3細胞增殖的影響

不同濃度(200.0,100.0,50.0,25.0,12.5,6.25,3.2 mg/L)的SPIO-herceptin-NOTA-AI18F與乳腺癌細胞作用后,細胞相對增殖率(RGR)分別為(99.28±13.21)%,(99.19±11.35)%,(99.03±12.57)%,(95.28±12.29)%,(94.29±12.46)%,(91.78±14.34)%,(90.27±13.18)%(見圖5),提示該納米顆粒對乳腺癌SK-BR3細胞毒性小。

圖5 不同濃度SPIO-herceptin-NOTA-AI18F對SK-BR3細胞的毒性作用Figure 5 Toxic effects of SPIO-herceptin-NOTA-AI18F on SK-BR3 cells

2.6 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F與SK-BR3細胞特異性結(jié)合

SPIO-herceptin-NOTA-AI18F與SK-BR3細胞的結(jié)合呈時間依賴性,符合抗原-抗體結(jié)合的反應(yīng)規(guī)律,其結(jié)合率在30 min時為(7.10±0.30)%,1 h時為(12.30±1.37)%,2 h時為(15.02±2.09)%,4 h時為(18.02±1.84)%(見圖6)。

圖6 SK-BR3細胞與SPIO-herceptin-NOTA-AI18F共培養(yǎng)不同時間結(jié)合率的變化Figure 6 Changes of the binding rate between the cells and the nanoprobes after coculture for different time

2.7 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布

尾靜脈注射SPIO-herceptin-NOTA-AI18F后,該納米顆粒主要分布在腫瘤組織、血液、肝臟、腎臟和脾臟,肌肉、骨骼中攝取較少。隨著時間的延長,各組織器官的放射性逐漸降低,下降最快的是血液,其次為肝臟和腎臟,主要經(jīng)肝臟代謝,腎臟排泄,10 min時該納米顆粒的放射性計數(shù)在肝臟為(18±0.76)%ID/g、腎臟為(6.5±0.61)%ID/g,48 h時上述器官的放射性均明顯下降,肝臟為(3±0.43%ID/g,腎臟為(1.2±0.02)%ID/g,分別降低了83.86%和81.53%(圖7)。

圖7 SPIO-herceptin-NOTA-AI18F在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布Figure 7 Biological distribution of SPIO-herceptin-NOTA-AI18F in tumor-bearing mice

3 討論

納米科技近年來在生物診斷、靶向藥物傳遞、基因治療等方面發(fā)揮了重要作用,其在分子影像研究中具有獨特的優(yōu)勢:首先納米顆粒(NPs)體積小(比正常細胞小2-4個數(shù)量級),能夠在其表面進行多種配體功能化,提高對受體的靶向識別能力,實現(xiàn)分子特異性成像;其次納米顆粒表面積與體積比較大,可與其他對比劑通過化學(xué)鍵結(jié)合,為實現(xiàn)多模態(tài)成像提供了平臺。超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)是臨床醫(yī)學(xué)研究上目前應(yīng)用較多的納米材料之一,SPIO-NPs直徑小(60-150 nm),穿透力強,具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性及生物降解性,代謝后進入正常血漿鐵池,且弛豫率為同樣條件下釓離子的7-10倍,在低濃度條件下即能夠形成T2WI陰性信號對比,已成為廣泛應(yīng)用的MR分子成像標(biāo)記物[10,12-14]。文獻中分子探針常用的放射性標(biāo)記物為64Cu、18F、68Ga、89Zr[5-8,14,15]等,其中18F是臨床最常用的PET-CT顯像劑,對回旋加速器能量要求低,容易獲得,且產(chǎn)率較高,其半衰期只有110 min,體內(nèi)代謝快,適合作為分子探針進行核素顯像;赫賽汀是抗HER2的單克隆抗體,能夠?qū)崿F(xiàn)與腫瘤細胞表面HER2受體特異性結(jié)合,因此能夠作為載體,將探針導(dǎo)向靶點。本研究通過特定的系列化學(xué)反應(yīng),最終得到18F標(biāo)記的HER2靶向磁性納米顆粒SPIO-herceptin-NOTA-AI18F,其具有良好的理化性質(zhì)和超順磁性,滿足PET/CT和磁共振雙模態(tài)檢查的需求。18F標(biāo)記后具有較高的放射化學(xué)純度和良好的穩(wěn)定性。體外實驗顯示,該納米顆粒與SK-BR3細胞膜上特異性抗原有高度親和力,荷瘤小鼠體內(nèi)實驗顯示放射性主要濃聚于肝臟和脾臟,說明該探針主要為肝脾攝取,隨時間延長,放射性攝取在10 min后達到峰值,其后逐漸下降,其在體內(nèi)的代謝及排泄與文獻報道一致[16-18],這些特征符合抗體在活體內(nèi)的分布及代謝規(guī)律,為后續(xù)體內(nèi)分子影像學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。HER2靶向納米探針基礎(chǔ)上進行的多模態(tài)分子成像將能夠活體檢測HER2表達水平,有助于臨床實現(xiàn)HER2陽性乳腺癌的術(shù)前無創(chuàng)性診斷,從而早期評價預(yù)后,為患者創(chuàng)造最佳治療時機。