去甲澤拉木醛對胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制

楊 楊,崔憶旋,胡 婷,趙夢琳,汪子書(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,蚌埠 233000;通訊作者,E-mail:wzshahbb@163.com)

胃癌不僅是全球第四大常見癌癥,也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。目前胃癌的治療包括手術(shù)、化療、放療和分子靶向治療,其中手術(shù)聯(lián)合放化療是最有效的治療方案[2]。然而,由于先天性或獲得性耐藥及術(shù)后復(fù)發(fā),胃癌治療已進(jìn)入瓶頸期[3]。因此,有必要尋找與胃癌進(jìn)展相關(guān)的新靶點(diǎn)和信號通路來治療胃癌。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞不受控制的增殖密切相關(guān),而許多惡性腫瘤細(xì)胞通過凋亡逃逸獲得無限的增殖能力[4]。在20世紀(jì)70年代,Kerr等[5]提出了凋亡與消除潛在的惡性細(xì)胞、增殖和腫瘤進(jìn)展相關(guān)的理論。目前凋亡的三種逃避機(jī)制被廣泛接受,包括死亡受體通路的損傷、Caspase功能的減弱、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的破壞[6]。因此,通過調(diào)控凋亡信號通路中關(guān)鍵蛋白或酶的表達(dá)或功能來靶向癌細(xì)胞凋亡成為癌癥研究的熱點(diǎn)[7]。此外,有報(bào)道稱一些天然產(chǎn)物可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號通路,最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡?？鄥A是從苦參中提取的生物堿,通過促進(jìn)促凋亡蛋白的表達(dá),改變Fas/FasL,激活Caspase-3,促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[8,9]。因此,從天然植物產(chǎn)物中尋找潛在的抗癌藥物成為一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。

去甲澤拉木醛是從雷公藤中提取的三萜單體,廣泛應(yīng)用于抗炎免疫調(diào)節(jié)、抗生育、雌激素代謝調(diào)節(jié)等研究[10-13],近年去甲澤拉木醛的抗癌特性也在逐漸被開發(fā)。研究表明,去甲澤拉木醛在三陰性乳腺癌、膠質(zhì)瘤及黑色素瘤中都發(fā)揮著明顯的抗腫瘤作用[14-16]。但是,去甲澤拉木醛對胃癌的抗癌活性及其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要探討去甲澤拉木醛對胃癌細(xì)胞(AGS)的影響及其可能機(jī)制,為胃癌的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人胃癌細(xì)胞AGS(人胃癌腺細(xì)胞系)購自美國American type culture collection公司,培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院癌癥醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心實(shí)驗(yàn)室。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)和雙抗(青霉素/鏈霉素)購自美國Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司,CCK-8試劑盒、BCA試劑盒、磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)購于上海碧云天公司,雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)購自杭州聯(lián)科生物公司,結(jié)晶紫購自上海生工生物工程公司,瑞氏-吉姆薩染色液購于南京建成科技公司,ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞AGS培養(yǎng)在含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在37 ℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的人胃癌細(xì)胞AGS,胰酶消化得單細(xì)胞懸液,離心,棄上清,再次加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基后計(jì)數(shù),在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl/孔),每孔約含5 000個細(xì)胞,培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞融合達(dá)80%左右加入不同濃度的去甲澤拉木醛(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,30,50 μmol/L)。將細(xì)胞放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h每孔加入10 μl的CCK-8溶液。繼續(xù)培養(yǎng)2 h,利用酶標(biāo)儀于分光度為450 nm處測OD值,計(jì)算細(xì)胞在不同濃度去甲澤拉木醛下的活力:細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%,計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的人胃癌細(xì)胞AGS,以每孔大約500個細(xì)胞接種于6孔板,依次加入0,0.05,0.1,0.5,1,10 μmol/L去甲澤拉木醛溶液。將6孔板放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)7 d,直到空白組形成多于200個細(xì)胞克隆時,終止培養(yǎng)。丟棄培養(yǎng)基,用預(yù)先冷卻的PBS溶液清洗兩遍后,每孔加滴加800 μl甲醇固定30 min,棄甲醇。向每個孔中滴加800 μl瑞氏-吉姆薩染色液試劑一,以覆蓋孔的底部,染色20 min。保留試劑一,滴加1 600 μl試劑二,輕輕搖晃,使兩種染液充分混勻,染色20-25 min,倒去兩種混合后的染色溶液,用自來水洗滌3次,自然風(fēng)干并拍照。使用軟件Image J,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖像的灰度統(tǒng)計(jì)并計(jì)算抑制率,計(jì)算公式為:克隆形成抑制率=給藥組的灰度值/溶劑對照組的灰度值×100%。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的人胃癌細(xì)胞AGS,將含2×105個細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液加入至上層小室,并在上層小室中分別加入不同濃度的去甲澤拉木醛(0,1,3,10 μmol/L),在下層小室內(nèi)加入600 μl的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,丟棄上腔液,去除膜表面殘留細(xì)胞。將小室用甲醇固定20 min,0.5%結(jié)晶紫染色20 min,最后,染色細(xì)胞用光學(xué)顯微鏡200倍放大觀察和拍照。使用軟件Image J計(jì)算細(xì)胞遷移的面積。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

選取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的AGS細(xì)胞,以每孔3×105的細(xì)胞密度接種于12孔板,待次日貼壁后加入濃度分別為0,1,3,10 μmol/L的去甲澤拉木醛,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集上清于對應(yīng)的流式管中,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,終止消化,將細(xì)胞收集到流式管中。500g離心5 min,棄上清,再用預(yù)冷的PBS清洗兩遍,此步最后一次PBS均分出雙陰、Annexin Ⅴ-FITC組和單PI組。每管加入400 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液(1×binding buffer)混勻;加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI染色液輕輕混勻于室溫避光15 min孵育染色;在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平

用不同濃度的去甲澤拉木醛(0,1,3,10 μmol/L)處理細(xì)胞24 h,0.25%胰酶消化,離心分離收集細(xì)胞,PBS漂洗2次,在冰上加入PIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,收集細(xì)胞的總蛋白,BCA法測定蛋白水平。將蛋白總量相同的樣本加入到12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)內(nèi)進(jìn)行蛋白分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶在室溫封閉2 h,TPBS洗滌7 min,重復(fù)3次。按1∶1 000的比例分別稀釋β-actin、ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3一抗,膜與不同的一抗4 ℃孵育過夜,次日用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(二抗)室溫下孵育2 h,ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間差異采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組間差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去甲澤拉木醛對AGS細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用

CCK-8結(jié)果顯示,AGS細(xì)胞經(jīng)不同濃度去甲澤拉木醛(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,30,50 μmol/L)處理24 h,細(xì)胞的存活率隨著去甲澤拉木醛濃度的升高而下降,表明去甲澤拉木醛對AGS細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用,作用24 h的IC50值為18.45 μmol/L。與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與0 μmol/L相比,*P<0.05

2.2 去甲澤拉木醛對AGS細(xì)胞具有增殖抑制作用

AGS細(xì)胞經(jīng)不同濃度去甲澤拉木醛處理7 d后,隨著去甲澤拉木醛濃度的增加,克隆形成數(shù)量明顯降低。與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。

2.3 去甲澤拉木醛抑制AGS細(xì)胞遷移

用不同濃度去甲澤拉木醛處理AGS細(xì)胞24 h,觀察其對細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,去甲澤拉木醛明顯抑制了胃癌細(xì)胞的遷移。此外,去甲澤拉木醛可抑制AGS細(xì)胞遷移,呈劑量依賴性(P<0.001,見圖3)。

圖2 去甲澤拉木醛對AGS細(xì)胞的增殖抑制作用Figure 2 The anti-proliferation activity of demethylzeylasteral in AGS cells

圖3 去甲澤拉木醛對AGS細(xì)胞遷移的抑制作用Figure 3 Demethylzeylasteral suppressed the migration of AGS cells

2.4 去甲澤拉木醛誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),流式分析結(jié)果顯示不同濃度的去甲澤拉木醛(0,1,3,10 μmol/L)作用于人胃癌AGS細(xì)胞24 h,細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡率明顯增高。與0 μmol/L相比,不同濃度作用后細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001,見圖4);不同濃度組之間細(xì)胞凋亡率相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖4)。

2.5 去甲澤拉木醛對AGS細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與0 μmol/L相比,不同濃度的去甲澤拉木醛(1,3,10 μmol/L)作用于人胃癌AGS細(xì)胞24 h,細(xì)胞的cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.001),而ERK1/2蛋白表達(dá)量無明顯變化(見圖5)。

圖4 不同濃度去甲澤拉木醛處理24 h對AGS細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of demethylzeylasteral on the apoptosis of AGS cells after treatment for 24 h

與0 μmol/L相比,**P<0.01,***P<0.001;與1 μmol/L相比,#P<0.05,##P<0.01;與3 μmol/L相比,&P<0.05,&&P<0.01

3 討論

胃癌是全球主要的健康威脅,是僅次于肺癌的第二大癌癥相關(guān)死亡原因。雖然早診率有所提高,但由于術(shù)后復(fù)發(fā)、獲得性耐藥、晚期轉(zhuǎn)移等原因[3],胃癌的治療效果仍不理想。尋找新的藥物來治療胃癌成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。去甲澤拉木醛是從雷公藤中提取的一種新型三萜類單體,具有廣泛的藥理作用。雖然已知它與乳腺癌[14]、膠質(zhì)瘤[15]和惡性黑色素瘤[16]有關(guān),但還需要進(jìn)一步的研究來確定它是否具有廣譜的抗腫瘤作用。

本研究的主要目的是探討去甲澤拉木醛對胃癌細(xì)胞的抗癌作用。為此在體外進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)探討去甲澤拉木醛對胃癌細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制。由CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知,去甲澤拉木醛對胃癌AGS細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性和增殖抑制作用,且呈濃度依賴性。除此之外,去甲澤拉木醛還可以抑制胃癌AGS細(xì)胞的遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡,由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑和死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑共同驅(qū)動[17]。而且這一復(fù)雜的機(jī)制涉及許多信號通路。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)是細(xì)胞凋亡機(jī)制的核心,因?yàn)樗鼈兗仁羌?xì)胞死亡的啟動者,又是細(xì)胞死亡的執(zhí)行者[18]。一旦被激活,作為啟動者的Caspases就會分裂執(zhí)行身份的Caspases,對特定的細(xì)胞底物進(jìn)行切割,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。Caspase-9在一個內(nèi)部的線粒體依賴通路中被激活,進(jìn)而導(dǎo)致Caspase-3的激活[20],活化后的Caspase-3可以觸發(fā)下游物質(zhì)PARP的裂解[21],導(dǎo)致染色質(zhì)裂解,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。本研究的結(jié)果與上述報(bào)道一致,表明去甲澤拉木醛可能是通過Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活來誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞凋亡。然而越來越多抗腫瘤的研究不僅針對細(xì)胞凋亡展開,細(xì)胞增殖、遷移等也是抗腫瘤不可或缺的靶點(diǎn),包含JNK、ERK和P38在內(nèi)的MAPK蛋白激酶信號通路在細(xì)胞增殖、生存和凋亡中發(fā)揮重要作用[23]。目前,ERK 1/2是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子,磷酸化后的ERK1/2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,激活多種轉(zhuǎn)錄因子包括c-Myc、NF-κB和CREB,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和生存等一系列生物過程[24,25]。因此,ERK通路的抑制劑已在臨床試驗(yàn)中被用作潛在的抗癌藥物[26]。而本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果表明去甲澤拉木醛能夠下調(diào)p-ERK1/2蛋白的表達(dá),從而進(jìn)一步影響胃癌AGS細(xì)胞的凋亡和增殖。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,去甲澤拉木醛具有抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)凋亡的作用,其機(jī)制可能與Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活和ERK1/2通路的下調(diào)有關(guān)。本研究為去甲澤拉木醛的開發(fā)及胃癌的治療提供了參考價值,但詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。