APMP廢液中半纖維素的羧甲基化及生物活性研究*

陳 婷，劉海棠,2,3，劉 婧，李 潔，安永貞，張曉晨

(1. 中國(guó)輕工業(yè)造紙與生物質(zhì)精煉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津 300457；2. 江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210042；3. 天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津 300457)

0 引 言

近年來(lái)隨著綠色生態(tài)觀念不斷深入人心，生態(tài)工業(yè)也逐漸符合當(dāng)今21世紀(jì)的綠色發(fā)展理念，隨著生物質(zhì)精煉的提出，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始重視生物質(zhì)原料和造紙廢液的綜合利用與開(kāi)發(fā)，不僅可以替代化石基材料，而且可以改善傳統(tǒng)利用方式的低效率、高污染的缺點(diǎn)[1-2]。

在造紙工業(yè)中最為矚目的APMP法制漿工藝，即堿性過(guò)氧化氫化學(xué)機(jī)械法[3]，具有高得率、紙漿強(qiáng)度好、低污染、低能耗等突出優(yōu)點(diǎn)，但大量半纖維素在各個(gè)工藝階段被逐步帶入廢液中[4]。因此對(duì)APMP廢液中的半纖維素等生物質(zhì)資源進(jìn)行回收利用，不僅能提高企業(yè)的效益，還符合現(xiàn)代生態(tài)工業(yè)的發(fā)展理念。

半纖維素是由幾種不同類(lèi)型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體。近年來(lái)，研究者在半纖維素轉(zhuǎn)化為糖[5]，化學(xué)品，燃料[6]等方面，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。半纖維素沿骨架和側(cè)鏈上分布的大量游離的羥基與低分子醇類(lèi)的化學(xué)性質(zhì)相似，可與酸反應(yīng)生成酯類(lèi)，與烷基化試劑反應(yīng)生成醚類(lèi)，酯化[7]與醚化[8]是最為重要的半纖維素衍生反應(yīng)。宋飛宇等采用醚化法制備了具有較高羧基含量、較高分子量的羧甲基半纖維素[9]，并將其與聚酰胺多胺-表氯醇樹(shù)脂類(lèi)濕強(qiáng)劑聯(lián)用以提高紙張的濕抗張強(qiáng)度。曾月[10]等制備了對(duì)Cu2+有良好吸附性能的羧甲基半纖維素/殼聚糖復(fù)合材料。有研究表明，多糖在羧甲基化之后具備良好的生物活性。別蒙[11]等以一氯乙酸為羧甲基化試劑合成的羧甲基茯苓多糖具有良好的抑菌活性。馮燕茹[12]等對(duì)羧甲基茯苓多糖進(jìn)行體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，改性后的茯苓多糖具有Fe3+的還原能力和對(duì)羥自由基的清除能力。這些研究成果結(jié)合半纖維素自身具有的生物相容性和生物可降解性，為羧甲基半纖維素的生物活性探究以及在生物醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

本文主要是從桉木APMP廢液中提取半纖維素，將其進(jìn)行羧甲基化改性，并對(duì)改性前后的半纖維素進(jìn)行生物活性探究，主要是抗氧化性，吸濕、保濕性和抑菌性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與材料

桉木APMP制漿廢液(山東造紙廠)，無(wú)水乙醇，氯乙酸，氫氧化鈉，硫酸亞鐵，過(guò)氧化氫，水楊酸，濃硫酸，硫酸銨，碳酸鈉，溴化鉀，枯草芽孢桿菌，沙門(mén)氏桿菌，酵母浸粉，牛肉膏，蛋白胨。

傅里葉紅外光譜儀(FT-IR 650，天津港東科技發(fā)展股份有限公司)，高效液相色譜儀(1200，美國(guó)Agilent)，紫外分光光度計(jì)(T6，北京普析儀器有限責(zé)任公司)，超凈工作臺(tái)。

1.2 半纖維素的提取

APMP廢液中提取半纖維素主要分為兩部分：(1)木素的分離：取一定量濃縮后的廢液于燒杯中，緩慢滴加濃硫酸(w%=72%)，調(diào)pH為1.7；再將其置于恒溫水浴鍋中加熱(45 ℃，30 min)，有沉淀生成；待廢液冷卻至室溫后將底部褐色沉淀(主要成分為木素)除去，留濾液備用。

圖1 APMP廢液中提取半纖維素的流程圖Fig 1 A flow chart for extracting hemicellulose from APMP waste liquor

(2)醇沉法提半纖維素：向?yàn)V液中緩慢滴加6 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào) pH至4；再加入無(wú)水乙醇(V濾液∶V無(wú)水乙醇=1∶4)，有淡黃色絮狀物質(zhì)出現(xiàn)，靜置24 h；24 h后懸浮液明顯分層，底部為淡黃色固體，除去上層溶液后對(duì)底部沉淀進(jìn)行2～3次洗滌(85%乙醇)，并放于真空干燥箱中干燥(40 ℃，24 h)；干燥后的粉末即半纖維素(HC)。

1.3 羧甲基半纖維素的合成

稱(chēng)一定量的半纖維素(HC)加入到50 mL的三頸燒瓶中，在30 ℃下加水溶解，在加入50%的NaOH，攪拌20 min后加入無(wú)水乙醇(V無(wú)水乙醇∶V水=4∶1)；繼續(xù)加入一定量的ClCH2COOH，溫度升至75 ℃，再加入剩余的NaOH，反應(yīng)2 h；結(jié)束后將上清液除去，殘?jiān)?5%乙醇進(jìn)行多次洗滌，真空干燥12 h，所得物質(zhì)為羧甲基半纖維素(CMHC)。

取代度的測(cè)定：0.2 g的CMHC充分溶解于50 mL的蒸餾水中，用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再用0.05 mol/L的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，至溶液pH為3.74為止，記錄所用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V。

按照公式(1)計(jì)算CMHC的取代度(DS)

DS=0.132B/(1-0.08B)

B=2MV/m

式中，m為CMHC的質(zhì)量，g;M為硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L;V是滴定所用的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL。

1.4 性能與表征

1.4.1 紅外光譜(FT-IR)測(cè)定

將HC，CMHC和溴化鉀(KBr)在105 ℃進(jìn)行烘干4 h。少量待測(cè)樣(HC，CMHC)分別和KBr以m(待測(cè)樣)/m(KBr)=1∶100的比例進(jìn)行充分研磨，壓片制樣，壓力為10 MPa，時(shí)間60 s，掃描范圍400～4 000 cm-1,分辨率4 cm-1。

1.4.2 抗氧化性測(cè)定

采用測(cè)定羥基自由基清除率的方法對(duì)HC和CMHC進(jìn)行抗氧化性評(píng)價(jià)。

稱(chēng)取50 mg樣品充分溶于8 mL蒸餾水中，配成母液，待用。取兩組試管，編號(hào)為A-(1～6)和B-(1～6)，設(shè)置一個(gè)空白樣。分別往A-1和B-1號(hào)試管中加入2 mL母液，再逐級(jí)稀釋?zhuān)油陜山M試管；向A組試管中依次加入2 mL的2 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2 mmol/L水楊酸溶液，充分搖勻，靜置10 min；再加入2 mL 的6 mmol/L過(guò)氧化氫溶液，混勻后置于37 ℃的恒溫水浴鍋中加熱30 min；使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)出A組在510 nm處的吸光度A1；同樣方法，用2 mL蒸餾水代替樣液，其他步驟不變，測(cè)定空白樣在510 nm處吸光度A0；B組試管中加入的過(guò)氧化氫溶液使用等體積蒸餾水代替，其他操作不變，測(cè)定吸光度A2。

根據(jù)公式(2)計(jì)算羥基自由基清除率：

1.4.3 吸濕、保濕性測(cè)定

在室溫下，精確稱(chēng)取0.5 g樣品各兩份，放入稱(chēng)量瓶中。準(zhǔn)備兩個(gè)干燥器，一個(gè)放有飽和的硫酸銨溶液(RH=81%)，另一個(gè)放有飽和的碳酸鈉溶液(RH=43%)，將樣品分別放置其中，12、24、48、72 h時(shí)分別稱(chēng)其質(zhì)量。記錄樣品放置前的質(zhì)量(記作X)樣品放置后的質(zhì)量(記作Y)。

根據(jù)公式(3)計(jì)算吸濕率：

在室溫下，精確稱(chēng)取0.5 g樣品各兩份，將稱(chēng)量好的樣品分別放入稱(chēng)量瓶中,用滴管向其滴加去離子水(樣品質(zhì)量10%左右)，質(zhì)量記為Y。將其分別放在兩個(gè)干燥器中,一個(gè)放有飽和的碳酸鈉溶液(RH=43%),另一個(gè)放置干硅膠，在12、24、48、72 h時(shí)分別稱(chēng)其質(zhì)量X。

根據(jù)公式(4)計(jì)算保濕率：

1.4.4 抑菌性測(cè)定

采用牛津杯法分別測(cè)定HC和CMHC的體外抑菌活性。實(shí)驗(yàn)所用菌種是沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)室自培。待測(cè)樣品用蒸餾水將其分別配制成濃度為20 mg/mL的溶液；按實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法依次進(jìn)行滅菌、倒板、涂抹菌液、倒入樣液和培養(yǎng)等步驟，并拍照、記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 半纖維素組分含量分析

表1為APMP廢液中提取的半纖維素通過(guò)兩步酸水解后用HPLC測(cè)定的單糖組分含量，結(jié)果顯示該半纖維素水解產(chǎn)物由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖組成，其中木糖含量最高為 68.52%，其次為葡萄糖28.84%，阿拉伯糖含量較低為2.64%可以得出，APMP廢液中提取的半纖維素的主要成分是木聚糖。

表1APMP廢液中半纖維素的單糖組分含量

Table1ThemonosaccharidecontentofhemicelluloseextractedfromeucalyptusAPMPwasteliquor

2.2 羧甲基半纖維素的合成

2.2.1 羧甲基半纖維素的反應(yīng)機(jī)理：

(1)堿化反應(yīng)

半纖維素在堿性環(huán)境中，糖單元的羥基被堿化成氧負(fù)離子，提高了親核性，另外，半纖維素在堿性條件下充分潤(rùn)脹甚至溶解，有助于醚化劑的滲透，一定程度上提高了后續(xù)醚化反應(yīng)的效率和均一性。

(2)醚化反應(yīng)

在堿性環(huán)境中，氯乙酸的α-C從背面進(jìn)攻半纖維素鏈上的氧負(fù)離子，發(fā)生了SN2雙分子親核取代反應(yīng)，并生成羧甲基半纖維素鈉[9]。

圖2 羧甲基半纖維素(CMHC)的反應(yīng)機(jī)理Fig 2 Reaction mechanism of carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

2.2.2 羧甲基半纖維素(CMHC)的取代度

圖3-a中表示溫度在75 ℃時(shí)，是合成CMHC的最佳溫度，此溫度下DS最大，為1.48；圖3-b是在75 ℃時(shí)，NaOH的用量對(duì)DS的影響，在NaOH/HC(mol/mol)為1時(shí)，DS最大，為1.47，NaOH的量過(guò)少時(shí)，半纖維素的親核性過(guò)低，NaOH用量過(guò)多時(shí)，副反應(yīng)被促進(jìn)，都不利于反應(yīng)進(jìn)行；圖3-c是在最佳溫度和NaOH用量時(shí)，醚化劑(ClCH2COOH)的用量對(duì)DS的影響，圖中可以看出，隨著ClCH2COOH用量的增加，醚化反應(yīng)更加充分，DS也逐漸提高，但是，當(dāng)ClCH2COOH/HC(mol/mol)為3時(shí)，會(huì)中和堿化過(guò)程中全部的堿，使后續(xù)的醚化反應(yīng)體系呈弱酸性，破壞醚化反應(yīng)所需的弱堿性條件，因而不利于CMHC的合成。以下表征是選用CMHC-12和HC進(jìn)行對(duì)比分析。

2.3 性能與表征

2.3.1 紅外光譜分析

從圖4-a HC的FT-IR圖中可以看出，1 129cm-1，619 cm-1是糖單元上醚鍵(C-O-C)的吸收峰，是木聚糖的特征峰，2 918 cm-1是 -CH2- 的吸收峰，說(shuō)明APMP廢液的乙醇沉淀物是以木聚糖為主要成分的半纖維素。從圖4-b CMHC的FT-IR圖中可以看出，1597 cm-1附近是羧基(-COOH)的(C=O)非對(duì)稱(chēng)振動(dòng)吸收，1420cm-1附近是與羧基相連的甲基(-CH3)的(C-H)振動(dòng)吸收、1 320 cm-1附近的(C=O)對(duì)稱(chēng)伸縮吸收增強(qiáng)，表明樣品中羧甲基(-OCH2-COOH)的存在，即半纖維素成功被羧甲基化。

圖3 溫度、堿用量和醚化劑用量對(duì)羧甲基半纖維素(CMHC)取代度(DS)的影響Fig 3 Effect of different temperature, amount of alkali and amount of etherifying agent on the degree of substitution of carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

圖4 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的紅外光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

2.3.2 抗氧化性

從圖中可以看出，HC和CMHC的羥基清除率都是隨著溶液濃度的增大而增大，但是二者存在一定的差異，在相同質(zhì)量濃度下，CMHC的抗氧化性要大于HC。

羥基自由基的清除主要有兩種機(jī)制:(1)待測(cè)樣品通過(guò)提供氫(H)離子將羥基自由基還原；(2)待測(cè)樣品與能活化H2O2的過(guò)渡金屬離子(如Fe2+)螯合，從而抑制羥基自由基的產(chǎn)生。經(jīng)分析可得，羧甲基化處理半纖維素的羥基自由基清除活性的機(jī)制，則可能是由于改性引入的羧甲基基團(tuán)能與Fe2+離子螯合，抑制H2O2活化，從而抑制Fenton反應(yīng)中羥基自由基的產(chǎn)生。并提高了其清除羥基自由基(·OH)的能力，即抗氧化性的提高[13-14]。

2.3.3 吸濕、保濕性

圖中可以看出，在0～24 h內(nèi)，吸濕速率快，在24 h后，吸濕速率趨于緩慢，基本處于飽和狀態(tài)。二者趨勢(shì)相同，但是在同一時(shí)刻，CMHC的吸濕性明顯高于HC。

圖7中，HC和CMHC在絕干環(huán)境(干硅膠)中，CMHC的保濕效果略大于HC，二者水分流失都快；在RH=43%的環(huán)境中，CMHC的保濕效果明顯優(yōu)于HC，在前24 h內(nèi)，水分流失較快，但保濕效果良好，直至72 h后，CMHC的保濕率還能保持在46.3%。

圖5 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的抗氧化性Fig 5 Oxidation resistance of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

通過(guò)上述對(duì)HC和CMHC的吸濕、保濕性分析，羧甲基基團(tuán)的引入有利于提高HC的吸濕、保濕性。CMHC在堿化反應(yīng)中破壞了半纖維素中木聚糖等大分子鏈上羥基之間形成的氫鍵，使糖鏈末端上的羥基基團(tuán)的吸收位點(diǎn)增加，且在醚化反應(yīng)中引入的羧甲基基團(tuán)能與水形成氫鍵，從而提高半纖維素的吸濕性；同時(shí)，分子鏈之間還相互交織成網(wǎng)狀，加之與水的氫鍵結(jié)合，起到很強(qiáng)的保濕作用。

2.3.4 抑菌性

由圖8可以看出，在相同質(zhì)量濃度(20 mg/mL)下，HC和CMHC對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門(mén)氏桿菌的抑菌性有所不同。觀察圖中的抑菌圈，HC對(duì)兩種菌均無(wú)明顯抑制作用；但CMHC對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14 mm，對(duì)沙門(mén)氏桿菌的抑菌圈直徑為15 mm，可見(jiàn)羧甲基改性后提高了半纖維素的抑菌能力。

圖6 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的吸濕性Fig 6 Hygroscopicity of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

圖7 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的保濕性Fig 7 Moisturizing properties of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

根據(jù)抑菌性的原理分析，CMHC的抑菌性可能是由于其能夠吸附在細(xì)胞的表面，一方面阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，另一方面改變了細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)流失，從而質(zhì)壁分離，起到殺菌抑菌的效果；或者CMHC溶液通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，和體內(nèi)帶有電荷的細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，從而發(fā)生絮凝現(xiàn)象，擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的生理活動(dòng)或阻斷細(xì)菌體內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖[15]。

圖8 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門(mén)氏桿菌的抑菌效果Fig 8 Antibacterial effects of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC) on Bacillus subtilis and Salmonella

3 結(jié) 論

(1)以桉木APMP廢液為原料進(jìn)行半纖維素的提取，并對(duì)其進(jìn)行羧甲基化改性，在最佳條件(NaOH/ClCH2COOH=1∶2)時(shí)，取代度最高為1.47；并對(duì)半纖維素和羧甲基半纖維素進(jìn)行紅外光譜分析，證明半纖維素被成功羧甲基化。

(2)對(duì)半纖維素和羧甲基半纖維素進(jìn)行生物活性分析，最終得CMHC的抗氧化性、吸濕性、保濕性都明顯高于HC，且改性后的CMHC具有較強(qiáng)的抑菌性，為未來(lái)在生物醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。