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    姜黃素PLGA納米顆粒的制備及表征

    2020-06-05 00:46:30朱迪冰趙海燕何建丹杜雨涵王少兵
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2020年3期
    關(guān)鍵詞:凍干粉二氯甲烷藥量

    朱迪冰,趙海燕,何建丹,杜雨涵,王少兵

    (中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,湖北 武漢 430074)

    姜黃素(Curcumin,Cur)是從姜科植物姜黃、郁金、莪術(shù)等根莖中提取出來(lái)的主要成分,是植物界天然的二酮類化合物,具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、保肝等多種藥理活性,且不良反應(yīng)輕微,藥源充足,極具開(kāi)發(fā)前景[1-2]。姜黃素可以治療阿爾茲海默病癥,它還可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,改變細(xì)胞受體連接以及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)來(lái)控制肝腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生、增加和轉(zhuǎn)移,所以常用于肝癌等的治療[3]。而由于姜黃素本身的限制條件,水溶解度較低,不易進(jìn)入細(xì)胞,在體內(nèi)半衰期短,代謝快,生物利用度較低,穩(wěn)定性差,不利于藥物發(fā)揮作用[4]。因此研究影響姜黃素穩(wěn)定性對(duì)于姜黃素制劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

    PLGA納米粒作為藥物載體,生物相容性好,具有良好的生物降解性,無(wú)刺激性,毒副作用小,經(jīng)酯鍵斷裂降解為乳酸和羥基乙酸,通過(guò)三羧酸循環(huán)被代謝為二氧化碳和水從體內(nèi)排出。PLGA納米粒在降解時(shí),納米粒表面會(huì)逐漸產(chǎn)生微孔,使藥物暴露在納米粒表面逐漸溶解釋放,達(dá)到長(zhǎng)效緩釋目的。納米粒具有靶向性,可以通過(guò)胞飲作用或者吞噬作用直接進(jìn)入細(xì)胞,因而可以避免細(xì)胞膜上的外排泵對(duì)藥物的外排作用,防止藥物被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬,從而提高療效[5]。

    本研究通過(guò)單因素試驗(yàn),采用PLGA為載體材料,PVA為乳化劑,以粒徑、包封率和載藥量為指標(biāo)篩選出姜黃素PLGA納米粒的最優(yōu)處方,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,為后續(xù)開(kāi)發(fā)姜黃素的新制劑提供了依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與材料

    高效液相色譜儀(Agilent 1100型,美國(guó)Agilent公司);高速離心機(jī)(TGL-16C,上海);超聲波細(xì)胞破碎儀(JY96-IIN,上海滬析實(shí)業(yè)有限公司);循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(III),河南省予華儀器有限公司);數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(85-2,金壇市科興儀器廠);傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET 6700型,美國(guó)Thermo Scientific);X射線衍射儀(XRD,D8型,德國(guó)Bruker)。

    材料:姜黃素(Cur),PLGA(50∶50,分子量5.5萬(wàn),濟(jì)南岱罡生物工程有限公司);聚乙烯醇(88%水解度,上海威呈化工有限公司);甲醇(色譜純,美國(guó)天地);其余試劑均為市售分析純。

    1.2 色譜條件

    色譜柱:Dikma Platisil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:甲醇-0.5%乙酸水(80∶20),柱溫:25 ℃,流速:1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):450 nm,進(jìn)樣量:10 μL。

    1.3 PLGA納米粒制備

    采用乳化溶劑揮發(fā)法制備Cur-PLGA-NPs[6],取20 mg PLGA溶于1 mL有機(jī)溶劑中,隨后將一定量藥物粉末溶于聚合物溶液中。所得的溶液逐滴加入2 mL 2% PVA水溶液中,冰浴中超聲20 min得到初乳。將初乳滴加到10 mL 0.5% PVA水溶液中,減壓蒸發(fā)1 h。5 000 rpm離心10 min除去大顆粒和析出的藥物,上清液在4 ℃、20 000 rpm離心30 min收集納米粒,再用適量蒸餾水洗滌2次,重新分散在少量蒸餾水中,冷凍干燥收集的納米粒,于低溫冷凍干燥機(jī)中干燥24 h,得到Cur-PLGA-NPs。

    1.4 包封率和載藥量的測(cè)定

    精密稱取5 mg Cur-PLGA-NPs,充分溶解于5 mL甲醇中,超聲20 min,通過(guò)0.22 μm微孔濾膜,HPLC法測(cè)納米粒中姜黃素含量。

    包封率計(jì)算公式:EE%=實(shí)測(cè)載藥量/理論載藥量×100%

    載藥量計(jì)算公式:DL%=納米粒中測(cè)得的藥物總量/納米??傎|(zhì)量×100%

    1.5 粒徑與粒徑分布

    將Cur-PLGA-NPs重新分散在蒸餾水中配制成混懸液,置于動(dòng)態(tài)光散射儀樣品池中進(jìn)行測(cè)定。

    1.6 性能表征

    透射電鏡(TEM):將Cur-PLGA-NPs凍干粉樣品分散在蒸餾水中稀釋成適當(dāng)濃度,將銅片浸泡在樣品溶液一段時(shí)間后自然干燥,TEM觀察并拍照。

    X射線衍射(XRD):取Cur、PLGA、Cur與PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs凍干粉進(jìn)行XRD射線衍射分析,工作條件:Cu靶,石墨單色器衍射單色化,管電壓50 kV,管電流200 mA,掃描范圍2θ為5° ~80°[7]。

    差示掃描量熱法(DSC):將Cur、PLGA、Cur與PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs凍干粉分別裝入鋁坩堝中,在靜態(tài)的空氣環(huán)境中測(cè)定,稱樣量約5 mg,升溫速度為10 ℃·min-1,溫度范圍為0~200 ℃。

    紅外光譜(IR):采用溴化鉀壓片法將Cur、PLGA、Cur和PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs凍干粉分別制備成樣品后進(jìn)行紅外掃描分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1 超聲時(shí)間考察 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法,保持其他條件不變,分別改變超聲時(shí)間,測(cè)定藥物的粒徑和載藥量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)20 min時(shí),粒徑和載藥量無(wú)明顯變化,因此選擇超聲時(shí)間為20 min。

    表1 超聲時(shí)間對(duì)粒徑和載藥量的影響

    2.1.2 有機(jī)溶劑對(duì)粒徑和載藥量的影響 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法,保持其他條件不變,改變有機(jī)溶劑丙酮與二氯甲烷比例,測(cè)定藥物的粒徑和載藥量,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),當(dāng)二氯甲烷混有丙酮時(shí),粒徑明顯降低,但隨著丙酮含量的增高,粒徑無(wú)明顯影響,可能的原因是二氯甲烷為水性不溶性溶劑,當(dāng)含有載體材料的二氯甲烷滴入水中,會(huì)形成油滴,這些油滴僅能依靠機(jī)械攪拌作用分散在水中,故形成的納米粒粒徑較大,而對(duì)于水溶性的丙酮,當(dāng)含有聚合物的有機(jī)溶劑被滴入水相時(shí),溶劑會(huì)立刻分散在水中,聚合物不易聚集在一起,故形成的納米粒粒徑較小[8]。

    隨著丙酮含量的增加,載藥量降低,分析其原因可能是溶劑極性過(guò)高,藥物容易朝水中泄露,因此選擇丙酮∶二氯甲烷體積比為1∶4。

    表2 有機(jī)溶劑對(duì)粒徑和載藥量的影響

    2.1.3 Cur投藥量的考察 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法,保持其他條件不變,姜黃素投藥量分別為1 mg、1.5 mg、2 mg、4 mg時(shí),納米粒的包封率和載藥量如圖1。由圖1可見(jiàn),包封率隨著Cur的投藥量增加而降低,而載藥量增高,由于當(dāng)投入Cur為4 mg時(shí),包封率大幅降低,因此選擇Cur投藥量為2 mg。

    圖1 Cur與PLGA比例對(duì)包封率和載藥量的影響

    2.1.4 初乳中PVA體積和濃度的考察 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法,Cur 1.5 mg,PLGA 20 mg,其他條件不變,考察初乳中PVA濃度和體積對(duì)包封率和載藥量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

    圖2 PVA濃度對(duì)包封率和載藥量的影響(一)

    圖3 PVA體積對(duì)包封率和載藥量的影響(二)

    由圖2可知,當(dāng)PVA體積分別為1、2、3、4 mL時(shí),包封率和載藥量均先增加后降低,可能的原因是當(dāng)水相和油相比例為1∶1時(shí),不易形成水包油,當(dāng)水相比例過(guò)大,導(dǎo)致初乳穩(wěn)定性降低,藥物容易朝水相中泄露,因此選擇初乳水相體積為2 mL。

    由圖3可知,當(dāng)PVA的濃度分別為1%、2%、4%時(shí),包封率和載藥量都是先增加后降低,可能的原因是PVA是乳化劑,PVA濃度在一定范圍內(nèi),對(duì)初乳的乳化效果會(huì)更好,因此可以裝載更多的藥物,但是當(dāng)PVA濃度繼續(xù)增大,包封率和載藥量開(kāi)始下降,可能是因?yàn)楦邼舛萈VA溶液過(guò)于黏稠,導(dǎo)致藥物更容易擴(kuò)散進(jìn)入水相,因此選擇PVA濃度為2%。

    2.2 最優(yōu)處方及三批重現(xiàn)

    根據(jù)單因素試驗(yàn),篩選出最優(yōu)處方為Cur 2 mg,PLGA 20 mg,有機(jī)溶劑組成為丙酮∶二氯甲烷=1∶4,初乳中PVA體積2 mL,濃度2%,超聲時(shí)間20 min。在最優(yōu)處方下制備的3批Cur-PLGA-NPs包封率、載藥量和粒徑如表3所示。

    表3 Cur-PLGA-NPs的包封率、載藥量和粒徑

    2.3 CUR-PLGA-NPs的表征

    2.3.1 透射電鏡法(TEM) Cur-PLGA-NPs的TEM圖像如圖4所示,納米粒微觀形態(tài)呈較規(guī)則的球形或類球型,均在納米尺寸范圍內(nèi),表明圓整光滑。

    圖4 Cur-PLGA-NPs的TEM圖像

    2.3.2 紅外光譜分析(IR) Cur、PLGA、物理混合物和Cur-PLGA-NPs凍干粉的IR圖譜如圖5。圖5顯示Cur在3 507.33 cm-1有-OH特征吸收峰,在1 629.65和1 598.78處有C=O特征吸收峰。PLGA在1 747 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。在包封的納米粒中,上述峰均存在,因此沒(méi)有新的化學(xué)鍵的形成。

    a)Cur;b)PLGA;c)physical mixtures;d)Cur-PLGA-NPs

    2.3.3 差示掃描量熱法(DSC) Cur、PLGA、物理混合物和Cur-PLGA-NPs的DSC圖譜見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)PLGA聚合物在50 ℃左右顯示出1個(gè)小峰,指的是玻璃化轉(zhuǎn)變后的弛豫峰,沒(méi)有觀察到明顯的熔點(diǎn),因?yàn)镻LGA本質(zhì)上是無(wú)定形的。Cur在174.7 ℃產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于結(jié)晶區(qū)熔點(diǎn)的尖峰,物理混合物也在此處出現(xiàn)了熔融吸熱峰,然而,在Cur-PLGA-NPs中未觀察到Cur的特征峰,這可能是由于Cur的結(jié)晶形式轉(zhuǎn)化為無(wú)定形形式[9]。

    a)Cur;b)PLGA;c)physical mixtures;d)Cur-PLGA-NPs

    2.3.4 X射線衍射(XRD) 為了進(jìn)一步了解Cur和PLGA聚合物之間的相互作用,使用X射線衍射(XRD),結(jié)果如圖7。由圖7可知,Cur的晶體特征峰并未在Cur-PLGA-NPs中顯示。這一現(xiàn)象可能表示了Cur的晶體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)形式,這與DSC的結(jié)果一致。

    a)Cur;b)PLGA;c)physical mixtures;d)Cur-PLGA-NPs

    3 結(jié)論

    以PLGA為載體材料,PVA為乳化劑,采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了Cur-PLGA-NPs,以包封率、載藥量和粒徑篩選了最優(yōu)處方為:Cur 2 mg,PLGA 20 mg,有機(jī)溶劑組成為丙酮∶二氯甲烷=1∶4,初乳中PVA體積2 mL,濃度2%,超聲時(shí)間20 min。在最優(yōu)處方下制備的Cur-PLGA-NPs進(jìn)行了表征,包封率為(49.1±1.68)%,載藥量為(4.5±0.15)%,平均粒徑為(167.5±4.3)nm。IR、XRD、DSC結(jié)果顯示,藥物晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型狀態(tài),藥物與載體之間不存在相互作用力。本實(shí)驗(yàn)成功制備Cur-PLGA-NPs,為Cur-PLGA-NPs的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

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