蒙成藥額日敦-烏日勒對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型(MCAO/R)大鼠血清及腦組織IL-6、IL-1β的影響

胡玉榮

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007)

腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。其發(fā)病率、死亡率及致殘率均較高，是目前導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦卒中屬于蒙醫(yī)白脈病范疇，命名為“薩病”[1]。蒙成藥額日敦-烏日勒是治療腦卒中的主方，而且有相關(guān)研究分析了蒙成藥額日敦-烏日勒治療腦卒中的機(jī)制[2]。本研究采用改良Zea-longa法，建立大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型(MCAO/R)[3]，觀察蒙成藥額日敦-烏日勒對(duì)腦缺血再灌注損傷后炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

額日敦-烏日勒(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院M14060733M)，血塞通片(Z53020181)，Wistar大鼠144只(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司)，線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)，水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán))，大鼠IL-6、IL-1β ELISA試劑盒(貨號(hào)分別為JM-01597R2、JM-02323M1)由江蘇晶美生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注損傷大鼠模型的構(gòu)建 選取144只體質(zhì)量為180～240 g健康雄性Wistar大鼠(山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK魯20110007)，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。采用改良Zea-longa法，實(shí)行左側(cè)MCAO手術(shù)。即將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至顱內(nèi)大腦前動(dòng)脈的近端，有阻力出現(xiàn)時(shí)即可停止插線(深度約18～20 mm)，結(jié)扎ICA的插線處以阻斷血流，造成腦缺血。90 min后將線栓稍稍向外拔出，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作同模型組，自由攝食飲水。

1.2.2 動(dòng)物分組 造模成功之后將144只大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組24只、模型組24只、治療組72只(額日敦-烏日勒高劑量組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只，額日敦-烏日勒中劑量組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只，額日敦-烏日勒低劑量組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只)、對(duì)照組24只。

1.2.3 給藥方法 造模24 h后開始灌胃給藥。額日敦-烏日勒高劑量組給予500 mg/kg，額日敦-烏日勒中劑量組給予250 mg/kg、額日敦-烏日勒低劑量組給予125 mg/kg，對(duì)照組給予血塞通片236.25 mg/kg。假手術(shù)組、模型組Wistar大鼠每日1次灌胃純凈水。

1.2.4 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分方法 使用Bederson神經(jīng)行為損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)[4]，評(píng)分內(nèi)容包括：0級(jí)：無神經(jīng)功能缺損癥狀，0分；Ⅰ級(jí)：提尾時(shí)對(duì)側(cè)肢體屈曲內(nèi)收(即提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)，1分；Ⅱ級(jí)：一側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)推力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)并有Ⅰ級(jí)癥狀，2分；Ⅲ級(jí)：自由活動(dòng)時(shí)間向癱瘓側(cè)劃圈并有Ⅱ級(jí)癥狀，3分；Ⅳ級(jí)：意識(shí)喪失，不能行走，4分，滿分4分。

1.2.5 動(dòng)物取材 分別再灌注1、3、7天給藥后，按照300 mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后，行神經(jīng)功能評(píng)分、心臟取血，3 000 r/min離心20 min后提取血清，-20 ℃冰箱凍存，速取出腦組織，于冰上迅速分離出缺血側(cè)皮層腦組織，分別裝入凍存管中，放入液氮中速凍2 h后，保存于-80 ℃。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo) 按ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清和腦組織中IL-6、IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蒙成藥額日敦-烏日勒對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

采用Bederson神經(jīng)功能缺損評(píng)分法對(duì)大鼠展開神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組動(dòng)物在造模之后，其神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，表明腦缺血再灌注造成神經(jīng)功能障礙的作用明顯；分別再灌注7天給藥后，治療組、對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組(P<0.05)，提示蒙成藥額日敦-烏日勒可提高腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能。見表1。

表1 額日敦-烏日勒對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 (分，

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，**P>0.05，#P<0.05。

2.2 蒙成藥額日敦-烏日勒對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注1、3、7天血清及腦組織中IL-6、IL-1β的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：wistar大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注1天模型組與假手術(shù)組相比血清、腦組織IL-6、IL-1β含量明顯升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。額日敦-烏日勒各組和血塞通組與模型組相比無明顯差異(P>0.05)。wistar大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注3天模型組與假手術(shù)組相比，血清、腦組織IL-6、IL-1β含量明顯升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；額日敦-烏日勒各組和血塞通組與模型組相比，血清、腦組織IL-6、IL-1β含量明顯降低，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。額日敦-烏日勒低劑量組和中劑量組與血塞通組相比無明顯差異(P>0.05)；額日敦-烏日勒高劑量組與血塞通組相比，血清、腦組織IL-6、IL-1β含量明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。wistar大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注7天模型組與假手術(shù)組相比，血清、腦組織IL-6、IL-1β含量明顯升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；額日敦-烏日勒各組和血塞通組與模型組相比明顯降低，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。額日敦-烏日勒低劑量組和中劑量組與血塞通組相比無明顯降低(P>0.05)；額日敦-烏日勒高劑量組與血塞通組相比，血清、腦組織IL-6，IL-1β含量明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。見表2、表3、表4、表5。

組別IL-1β腦組織1天3天7天假手術(shù)組30.36±2.5529.93±1.3527.49±4.25模型組53.13±3.33#52.61±4.30#47.69±1.16#血塞通組53.56±6.11??40.25±6.60?36.11±1.81?額日敦-烏日勒低劑量組52.95±6.63??35.23±4.67?△34.00±3.52?△額日敦-烏日勒中劑量組51.32±2.95??34.99±5.43?△33.48±5.35?△額日敦-烏日勒高劑量組50.22±5.07??32.55±4.40?○30.90±2.95?▽

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.01；與模型組相比，**P>0.05，*P<0.01；與血塞通相比，△P>0.05，▽P<0.01，○P<0.05。

組別IL-1β血清1天3天7天假手術(shù)組27.75±2.5729.50±4.1929.71±3.16模型組57.69±2.37#55.63±6.39#46.56±2.65#血塞通組56.51±6.55??41.73±5.91?37.08±4.36?額日敦-烏日勒低劑量組56.59±2.53??36.34±4.81?△34.13±3.49?△額日敦-烏日勒中劑量組55.56±4.62??35.29±6.20?△32.87±3.75?△額日敦-烏日勒高劑量組53.99±5.59??33.19±6.30?○30.87±5.32?○

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.01；與模型組相比，**P>0.05，*P<0.01；與血塞通相比，△P>0.05，▽P<0.01，○P<0.05。

組別IL-6腦組織1天3天7天假手術(shù)組105.21±6.53112.12±16.16106.37±6.78模型組159.48±14.08#200.52±22.43#183.85±15.16#血塞通組154.06±6.47??161.43±13.45?150.17±7.94?額日敦-烏日勒低劑量組156.64±6.77??157.88±8.31?△149.99±8.27?△額日敦-烏日勒中劑量組153.89±4.81??154.14±8.61?△145.10±6.80?△額日敦-烏日勒高劑量組148.69±9.03??149.09±8.90?○137.66±5.96?▽

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.01；與模型組相比，**P>0.05，*P<0.01；與血塞通相比，△P>0.05，▽P<0.01，○P<0.05。

組別IL-6血清1天3天7天假手術(shù)組103.79±4.90105.76±6.58108.81±4.34模型組150.93±12.90#184.85±10.85#163.00±9.78#血塞通組144.55±6.67??147.73±9.95?135.06±7.26?額日敦-烏日勒低劑量組142.19±11.64??145.60±9.17?△133.77±5.84?△額日敦-烏日勒中劑量組145.67±6.35??141.66±10.13?△128.60±6.10?△額日敦-烏日勒高劑量組150.76±3.13??133.08±3.22?▽111.89±2.84?▽

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.01；與模型組相比，**P>0.05，*P<0.01；與血塞通相比，△P>0.05，▽P<0.01，○P<0.05。

3 討論

蒙醫(yī)學(xué)腦卒中屬于蒙醫(yī)白脈病范疇，命名為“薩病”。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為薩病是“因眾多外因所致體內(nèi)三根(赫依、協(xié)日、巴達(dá)干)失調(diào)，赫依與奇素相搏引起腦-白脈之海受損而導(dǎo)致發(fā)病”。蒙成藥額日敦-烏日勒是治療薩病的主方，臨床療效顯著，且毒副作用小?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中記載額日敦-烏日勒由珍珠(制)20 g，紅花15 g，石膏、梔子、降香、草果仁、海金沙、訶子、沉香、川楝子、白豆蔻、楓香脂、檀香各15 g，決明子、土木香、方海、肉桂、丁香、木香、地錦草、肉豆蔻、苘麻子、甘草、白巨勝、蓽撥、黑種草子各10 g，牛黃5 g，麝香0.5 g，水牛角濃縮粉30 g等二十九味藥物組成。本方性涼，以鎮(zhèn)靜及醫(yī)治白脈之良藥珍珠為主[5]。研究表明額日敦-烏日勒在防治缺血性腦血管病、腦出血、高血壓合并腦出血、面癱等疾病方面的臨床療效顯著[6]，具有抑制炎癥反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化形成、發(fā)展和穩(wěn)定易損斑塊的作用[7]，清除和抑制自由基，能明顯抑制異常增高的白細(xì)胞聚集，還有明顯的降脂等作用[8]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，腦梗死過程中炎癥反應(yīng)促進(jìn)了腦缺血損傷的發(fā)展，是加重缺血性腦損傷和神經(jīng)損傷的重要病理機(jī)制之一[9]。腦缺血損傷后在缺血受損區(qū)有細(xì)胞因子的過量表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，過量炎癥因子的產(chǎn)生可加重神經(jīng)細(xì)胞損傷[10]。IL-6具有廣泛的生物學(xué)活性，是一種單鏈蛋白細(xì)胞因子，在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞缺血時(shí)，IL-6可小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元合成IL-6，而IL-6表達(dá)水平的高低是衡量CIRI程度的重要指標(biāo)[11]。

IL-1(IL-1a、IL-1β)的來源十分廣泛，腦缺血后由活化的星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞分泌，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，從而加重局部炎性反應(yīng)。研究表明，大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠腦組織中IL-1β水平6h開始增高，24 h達(dá)到高峰，說明IL-1β參與了腦缺血再灌注損傷后的炎性反應(yīng)[12]。尤其是 TNF-a、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子[13-14]過度釋放，致使血腦屏障受損，加重腦損傷及腦水腫，形成缺血炎癥惡性循環(huán)。

本研究表明wistar大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注1、3、7天模型組與假手術(shù)組相比，血清、腦組織IL-6、IL-1β含量明顯升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。再灌注3、7天額日敦-烏日勒各組和血塞通組與模型組相比，血清、腦組織IL-6，IL-1β含量明顯降低，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。再灌注3、7天尤其是額日敦-烏日勒高劑量組與血塞通組相比，血清、腦組織IL-6，IL-1β含量明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P <0.05)。此實(shí)驗(yàn)說明額日敦-烏日勒治療缺血型腦卒中有一定的臨床療效，其作用途徑可能是通過抑制IL-6、IL-1β的表達(dá)而起到神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。