人參總皂苷對皮膚細胞的修復作用機制研究

鹿 禛，邱智東，王 蕾，陳江麗，金 葉

（長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117）

衰老是自然界最基本的規(guī)律之一[1]，皮膚衰老是指皮膚在外源或內(nèi)源性的因素影響下皮膚出現(xiàn)的外部形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及功能衰退的過程。內(nèi)源性因素指的是皮膚細胞的自然衰老；而皮膚因外界環(huán)境因素或生活方式的原因而出現(xiàn)的皮膚松弛、干燥及皺紋、色斑等現(xiàn)象則被稱為皮膚老化的外源性因素，其中最主要的因素就是紫外線照射，所以外源性老化也被稱為皮膚的光老化[2]。人參為五加科人參屬多年生草本植物人參的干燥根[3]，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，人參具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗衰老等作用[4-7]。

根據(jù)以上，本研究通過建立人皮膚成纖維細胞（CCC-HSF-1）衰老模型，利用蛋白質(zhì)印跡法 （Western Blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白探究人參總皂苷對人皮膚成纖維細胞（CCC-HSF-1）凋亡的影響，觀察人參總皂苷能否通過影響細胞凋亡來發(fā)揮其抗衰老功效，并通過建立大鼠光老化模型，觀察人參總皂苷對紫外線引起的大鼠皮膚光老化的修復效果[8]。

1 實驗材料

人參總皂苷（上海源葉生物有限公司）；阿霉素（DOX）（吉林大學實驗室配置）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國gibco）、PBS、胰酶（實驗室配制）、青霉素鏈霉素雙抗（Hyclone）、胎牛血清（gibco）；Cell counting kit-8 試劑盒（博士德生物）、臺盼蘭（Solarbio）、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物）、Hoschst 33342 染色液（Solarbio）、FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD PharmingenTM） ；Gapdh、BaX、Bcl-2、Cleaved-caspase3、抗體Goat anti-Mouse ISG HRP、Goat anti-RabbitISG HRP。酶標儀（MOLECULAR DEVICES）；電泳儀（WEALTEC）；自動細計數(shù)儀（Invitogen CountessTM）；培養(yǎng)箱（Thermo Scientofic 371）、生物安全（Thermo 1300 Series A2）柜；水浴鍋（Thermo Fisher Scientific Precision GP 05）；離心機（Thermo Scientific HERACUS MEGAFUGE ）；顯微鏡（Invitrogen By Thermo Fisher Scientific,EVOS XIL Core）；流式細胞儀（Beckman Gytoflex）；智能成像系統(tǒng)（i Bright FL1500）；全自動細胞成像系統(tǒng)（EVOS FL Auto）；紫外輻照箱（自制）；紫外線燈管（UVA：340-40W，波長范圍320～400 nm；UVB 313-40W，波長范圍300～320 nm）荷蘭Philips 公司；UV-A 型紫外輻照計（北京師范大學光電儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將人皮膚成纖維細胞（CCC-HSF-1）接種于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含15%胎牛血清、1%鏈霉素-青霉素）中，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 以1:3 的方式傳代1 次，取第3 或第4代細胞進行實驗。

2.2 CCK-8 法檢測不同濃度DOX 處理CCC-HSF-1 細胞的存活率 取處于對數(shù)生長期的人皮膚成纖維細胞用胰酶消化，以每孔200 μL 細胞懸液即每孔5×103個細胞接種于96 孔板中，之后將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中，在37 ℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁生長良好且細胞密度達到30%～40%時吸除細胞培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的DOX（0，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L）處理12 h，按照CCK-8 試劑盒說明書處理后，用酶標儀檢測細胞的吸光值（OD），波長調(diào)整為450 nm。細胞存活率的計算公式為：細胞存活率＝（樣品組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

2.3 CCK-8 法檢測不同濃度DOX 和人參糖肽處理CCC-HSF-1 細胞的存活率 將處于對數(shù)生長期的人皮膚成纖維細胞接種于96 孔板中，37 ℃孵育，待細胞生長至融合狀態(tài)時，棄去原培養(yǎng)基，加不同濃度DOX（0，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L）處理12 h 后，再加入濃度為1.00 mg/mL 人參總皂苷處理48 h，最后按2 中的方法計算各組細胞存活率。

2.4 Hoschst 33342 染色檢測CCC-HSF-1 細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的人皮膚成纖維CCC-HSF-1 細胞，分為空白組（不加DOX 和人參總皂苷），模型組（只加DOX 0.5 μmol/L）和給藥組（0.30 mg/mL 和1.00 mg/mL的人參總皂苷）將其以8×104/mL 接種于6 孔板中，在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基，在模型組和給藥組分別加入DOX 處理12 h 后，再在給藥組中加入不同濃度的人參總皂苷（0.30 mg/mL 和1.00 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后加入1 mL Hoechst 33342 工作液，37 ℃避光孵育30 min，棄染色液，用PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

2.5 Annexin V/PI 雙染色檢測CCC-HSF-1 細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的人皮膚成纖維CCC-HSF-1 細胞接種于6 孔板中，按上2.3 的方法處理48 h 后，棄上清，用不含EDTA 胰酶消化，1 400 r/min，離心5 min，收集細胞單懸液，再用PBS 洗3 遍后，加入200 μL Binding buffer、5 μL 的Annexin V FITC 染液和5 μL PI染色液，混勻，避光，室溫孵育15 min，用流式細胞儀進行檢測。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法 （Western Blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白 同上方式對細胞進行分組處理，48 h 后收集細胞樣品，PBS 洗3 遍后，加入RAPI 裂解液裂解4 h 以上，120 000 r/min，離心30 min，收集上清，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后，制備120 μL 的蛋白樣品。蛋白樣品用SDS 聚丙烯凝膠分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，加入一抗（Gapdh、BaX、Bcl-2、Cleaved-caspase3），4 ℃孵育過夜，第二天PBST洗滌3次，加入經(jīng)辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1.5 h 后，洗膜，顯色。

2.7 大鼠紫外線急性損傷模型的建立

2.7.1 分組 32 只SD 大鼠，隨機分為4 組：正常對照組、模型對照組、陽性（維生素E）對照組以及人參總皂苷組。

2.7.2 動物剃毛 分組后單籠飼養(yǎng)在專用鼠籠中，環(huán)境設(shè)施符合實驗動物清潔級別，溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%，光照符合晝夜交替。適應性飼養(yǎng)1 周后開始輻照。輻照前，參照文獻[9-10]對大鼠背部皮膚進行剃毛處理，面積大約為3 cm×3 cm。

2.7.3 照射 照射前對UVA 及UVB 輻射強度進行測量，37.34 J/cm2為最小紅斑量（minimum erythema quantity）。將剃毛后的大鼠放入自制的紫外線燈箱中，固定照射距離為10 cm，進行紫外線（UVA 加UVB）照射。直至造模結(jié)束，即大鼠背部皮膚出現(xiàn)干燥，起皮，甚至局部有潰爛現(xiàn)象。

2.7.4 給藥 除正常對照組及模型對照組外，陽性對照組和人參總皂苷組分別于實驗動物背部涂抹等濃度的維生素E 及人參總皂苷溶液，連續(xù)給藥1 周后觀察各組大鼠皮膚狀態(tài)。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同濃度DOX 處理CCC-HSF-1 細胞的存活率 CCK-8 結(jié)果顯示（圖1），經(jīng)DOX 處理后，與空白組相比，隨著DOX 的濃度的增加，細胞存活率明顯下降（P＜0.01），并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖1 不同濃度DOX 處理CCC-HSF-1 細胞的存活率

3.2 不同濃度DOX 和人參總皂苷共同處理CCCHSF-1 細胞的存活率 由圖2 中可以看出，加入人參總皂苷后，與圖1 相比，細胞存活率明顯提高（P＜0.01)，說明人參總皂苷對DOX 損傷的CCC-HSF-1 細胞有一定的修復作用。

圖2 不同濃度DOX 和人參總皂苷共同處理CCC-HSF-1細胞的存活率

3.3 人參總皂苷對人皮膚成纖維細胞凋亡有明顯的抗凋亡活性 利用DOX建立CCC-HSF-1細胞凋亡模型。經(jīng)Hoechst 33342 染色后，在熒光顯微鏡下觀察到，空白組細胞形態(tài)規(guī)則，胞核完整，染色均勻，經(jīng)DOX處理12 h 后的模型組，細胞形態(tài)及細胞核發(fā)生改變，而加入人參總皂苷后的給藥組，鏡下可見凋亡細胞的數(shù)量明顯的減少（圖3）。

圖3 Hoechst 33342 染色的細胞凋亡結(jié)果

利用流式細胞儀對CCC-HSF-1 細胞凋亡模型進行Annexin V/PI 雙染，結(jié)果如圖4（A-D）所示，與空白對照組相比，模型組具有明顯的細胞凋亡現(xiàn)象（18.36%）；而加入人參總皂苷修復后CCC-HSF-1 細胞的凋亡率（15.53%，9.09%）與模型組（0.5 μmol/L DOX）相比有明顯的下降（P＜0.05）。證明人參總皂苷對皮膚成纖維細胞具有明顯的抗凋亡活性。

圖4 流式細胞術(shù)檢測人參總皂苷和DOX 處理后各組CCC-HSF-1 細胞的凋亡率

3.4 人參總皂苷對凋亡相關(guān)蛋白的作用研究 利用人參糖肽處理DOX 誘導凋亡的CCC-HSF-1 細胞，并通過Western Blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，與模型組相比，各給藥組BaX、Cleaved-caspase3 蛋白水平明顯降低，Bcl-2 蛋白水平上升，證明人參總皂苷能抑制DOX 損傷所帶來的凋亡，對CCC-HSF-1 細胞有一定的修復作用。

圖5 人參總皂苷對CCC-HSF-1 細胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控作用

3.5 人參總皂苷對紫外線照射致大鼠皮膚光老化的修復作用研究 為了檢測人參總皂苷對紫外線所致皮膚損傷的保護作用，我們建立了紫外線損傷大鼠模型。結(jié)果如圖6 所示，空白對照組大鼠剃毛，不接受紫外線照射，皮膚光滑細膩，紋理清晰，沒有明顯的紅斑和皺紋，皮膚狀態(tài)健康；模型對照組剃毛后只接受紫外線照射而不給予藥物治療，皮膚顏色變紅，皮膚發(fā)緊，起皮，有波紋狀皺紋出現(xiàn)，局部有潰爛現(xiàn)象；陽性對照組（維生素E）大鼠剃毛照射后給予陽性藥物（維生素E）治療1周后皮膚有少量起皮現(xiàn)象，有少許褶皺，略微發(fā)紅；人參總皂苷組大鼠剃毛照射后給予人參總皂苷治療1 周后皮膚有較少的起皮現(xiàn)象，接近正常對照組。通過對4 組大鼠皮膚狀態(tài)的觀察說明人參總皂苷能夠有效修復紫外線照射導致的皮膚損傷。

圖6 人參總皂苷對紫外線照射致大鼠皮膚急性損傷的修復作用

4 結(jié)論

衰老是生物體隨著年齡的增長，機體內(nèi)組織、器官等功能退化的過程。而衰老的結(jié)果是體內(nèi)和體外共同作用的結(jié)果。皮膚同機體其他器官一樣，在內(nèi)源性和外源性因素的共同作用下，將不可避免的產(chǎn)生老化。許多中藥含有多種氨基酸、多糖、有機酸、生物堿、皂苷成分，他們具有清除自由基，增強抗氧化的能力，能提高皮膚膠原纖維及膠原蛋白含量，調(diào)節(jié)機體免疫功能，改善皮膚微循環(huán)等[11]。本研究利用DOX 建立人皮膚成纖維細胞凋亡模型，通過一系列生化實驗，研究了人參總皂苷對人皮膚成纖維細胞凋亡的影響：人參總皂苷通過上調(diào)Bcl-2 蛋白水平，降低BaX、Cleaved-caspase3 蛋白水平來抑制由DOX 引起的細胞凋亡；通過建立大鼠紫外光老化模型，對實驗各組大鼠皮膚狀態(tài)的觀察，可以看到人參總皂苷對紫外線造成的大鼠皮膚損傷具有較好的修復作用。