蜂毒素靶向PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡

李玲霞，張英民

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 洛陽(yáng) 471000）

肺癌是一類世界范圍內(nèi)常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中都居于首位[1]。非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的一類肺癌類型，占肺癌總發(fā)病率的80%左右[2]。肺癌發(fā)病前期并無(wú)明顯臨床癥狀，因此往往確診時(shí)已經(jīng)是晚期。腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤惡化的主要原因，而大部分腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力是通過(guò)死亡逃逸獲得的[3]，因此，尋找安全有效的靶點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖成了腫瘤研究的熱點(diǎn)。

蜂毒是蜜蜂工蜂分泌的一種毒液，蜂毒素（Melittin，Mel）是從蜂毒中提取的一種小分子蛋白，具有抗菌、抗病毒及抗炎鎮(zhèn)痛作用[4]，蜂毒素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，且作用靶點(diǎn)多樣化，包括直接殺傷細(xì)胞、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞血管生成等方面[5-6]。本研究中，我們探討了蜂毒素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討了其可能存在的作用機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療尋找更安全、有效的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞與試劑 人源性非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；蜂毒素購(gòu)自上海吉爾公司；含雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hy Clone 公司，MTT 試劑盒、Annexin V FITC/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；兔抗人PTEN、p-PI3K 多克隆抗體、鼠抗人p-Akt 單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，p53、CytC 及內(nèi)參序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代 將凍存的A549 細(xì)胞復(fù)蘇、重懸于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70%以上時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化、重懸，按1:3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取傳代后對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將細(xì)胞分為4 組，分別為對(duì)照組、Mel 低劑量組、Mel 中劑量組和Mel 高劑量組，依次向各組細(xì)胞內(nèi)加入不同濃度的蜂毒素，調(diào)整最終濃度為0、1、2、4 mg/L，每個(gè)濃度組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，加入20 μL 的MTT 試劑，培養(yǎng)箱中孵育4 h，離心，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL，充分震蕩至澄清無(wú)結(jié)晶，于紫外分光光度計(jì)480 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（OD 值），增殖抑制率（%）=（1-處理組OD/對(duì)照組OD 值）×100%。

1.4 Annexin V FITC/PI 聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種至6 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個(gè)，每孔內(nèi)加細(xì)胞懸液2 mL，按1.3 所示分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌2 次，離心，將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer 中，加入5 μLAnnexin V-FITC 混勻，室溫條件下避光反應(yīng)15 min，繼續(xù)加入300 μLBinding Buffer，上流式細(xì)胞儀前加入5 μLPI，之后1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PTEN、p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種至6 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個(gè)，每孔內(nèi)加細(xì)胞懸液2 mL，按1.3所示分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，取30 μg 待測(cè)樣本蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入封閉液搖床孵育2 h，加入稀釋一抗（1:1 000），4 ℃搖床過(guò)夜，加入稀釋二抗（1:5 000），常溫孵育2 h，洗膜后暗室中曝光顯影。以內(nèi)參β-actin為對(duì)照，采用Quality One 分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin 比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53 和CyclinD1 基因表達(dá) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種至6 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個(gè)，每孔內(nèi)加細(xì)胞懸液2 mL，按1.3 所示分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，Trizol 提取總RNA，異丙醇處理后收集RNA 沉淀，75%乙醇洗滌，離心，棄上清液，DEPC 水溶解RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行灰度掃描分析，比較目的基因與β-actin 條帶灰度之比。引物序列：p53 上游引物：5’-TCGGATTCGGATCGATCGGC-3；下游引物：5’-GCTTAGCTTTCGATCGGATC-3’；CyclinD1 上游引物：5’-TAGCTTTGCTAGCCTACGAT-3；下游引物：5’-TAGCTATTGCTAGGGGCTTA-3’；GAPDH 上 游引物：5’-TAGCTTTAGCTAGGGCTTAG-3；下游引物：5’-TAGCTTTAGCTAGCTTTAGC-3’。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計(jì)量資料間的比較用ANOVA檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蜂毒素對(duì)A546 細(xì)胞增殖活性的影響 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蜂毒素處理組細(xì)胞的增值抑制率顯著增加（P＜0.05），且抑制效果與藥物濃度呈正相關(guān)；Melittin 低劑量組24 h 和48 h 間抑制率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而72 h 抑制率顯著高于24 h（P＜0.05），同時(shí)，中劑量和高劑量組的抑制效果隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，呈時(shí)間依賴性（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 各組A549 細(xì)胞增殖抑制率

2.2 蜂毒素對(duì)A546 細(xì)胞凋亡的影響 蜂毒素作用組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，凋亡率隨之增加（P＜0.05），各藥物濃度組間存在顯著性差異（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率

2.3 蜂毒素對(duì)A546 細(xì)胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)的影響 蜂毒素作用組細(xì)胞PTEN 的蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)，隨著藥物濃度的增加，蜂毒素對(duì)PTEN 表達(dá)的誘導(dǎo)作用和對(duì)p-PI3K 和p-Akt 的抑制作用隨之增加，各藥物劑量組之間存在顯著性差異（P＜0.05）（見圖3，表1）。

圖3 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)

表1 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)（，n=5）

表1 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)（，n=5）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與Mel 低劑量組比較，△P ＜0.05；與Mel 中劑量組比較，▲P ＜0.05

2.4 蜂毒素對(duì)A546 細(xì)胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達(dá)的影響 蜂毒素作用組細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA 的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隨著藥物濃度的增加，表達(dá)量遞增（P＜0.05）；蜂毒素作用組細(xì)胞內(nèi)CyclinD1 mRNA 的表達(dá)顯著弱于對(duì)照組（P＜0.05），隨著藥物濃度的增加而遞減（P＜0.05）（見表2）。

表2 各組細(xì)胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達(dá)水平比較（，n=5）

表2 各組細(xì)胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達(dá)水平比較（，n=5）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與Mel 低劑量組比較，△P ＜0.05；與Mel 中劑量組比較，▲P ＜0.05

3 討論

蜂毒素是從蜂毒中提取出來(lái)的活性物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，其抗腫瘤作用已在多種腫瘤細(xì)胞中得到證實(shí)，蜂毒素能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[5-9]。本研究中，我們檢測(cè)了不同濃度蜂毒素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示，低劑量蜂毒素即能有效抑制其增殖活性，這種作用隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)，同時(shí)，蜂毒素能顯著促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡，這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂毒素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，為了進(jìn)一步了解蜂毒素對(duì)A549 細(xì)胞的作用機(jī)制，我們進(jìn)一步探討了其對(duì)A549 細(xì)胞中PTEN/PI3K/Akt 通路相關(guān)分子表達(dá)的影響。

人第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物（Gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）是目前已知的能抑制腫瘤活性的磷酸酶[10]，磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/絲氨酸—蘇氨酸激酶（Protein kinase B,Akt）信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，其異?；钅艽龠M(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞的凋亡[11]。有研究證實(shí)，在腫瘤細(xì)胞中，PTEN 通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K/Akt 通路，阻斷該通路活性從而發(fā)揮抑癌作用[12]。在肺癌細(xì)胞的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，PI3K 抑制劑GSK2636771 能抑制PTEN 表達(dá)缺失的肺癌細(xì)胞株的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，將載有PTEN 基因的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后，PI3K 抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響增強(qiáng)，說(shuō)明該通路在肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。有報(bào)道稱，蜂毒素能上調(diào)HepG2 肝癌細(xì)胞中PTEN 并抑制下游Akt 通路的激活，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖[14]?；谝陨侠碚摚狙芯恐?，我們探討了蜂毒素對(duì)A549 細(xì)胞中PTEN/PI3K/Akt 通路中相關(guān)分子表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，蜂毒素能刺激A549 細(xì)胞中PTEN 的表達(dá)，同時(shí)抑制PI3K 和Akt的磷酸化，且這種作用隨著藥物劑量的增加而加強(qiáng)，說(shuō)明蜂毒素能有效調(diào)控A549 細(xì)胞內(nèi)PTEN/PI3K/Akt 通路的活性。

為了進(jìn)一步探討蜂毒素對(duì)A549 細(xì)胞的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了蜂毒素對(duì)PTEN/PI3K/Akt 通路兩個(gè)重要的下游因子的作用。p53 是PI3K/Akt 信號(hào)通路的一個(gè)下游抑癌基因，p53 被活化后能通過(guò)上調(diào)Caspase-3 和Caspase-9 而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PI3k/Akt 通路的活化能引起p53的降解，從而影響細(xì)胞凋亡[15]，同時(shí)有研究證實(shí)，p53 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡在肺癌細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。cyclinD1 是PI3K/Akt 通路的另一下游分子，其過(guò)表達(dá)時(shí)能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞周期發(fā)生異常變化，對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖起到重要作用[17]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，蜂毒素能誘導(dǎo)A549 細(xì)胞中p53 蛋白的表達(dá)，而抑制cyclinD1 的表達(dá)，且這種作用呈劑量依賴性，說(shuō)明蜂毒素可能時(shí)通過(guò)抑制PTEN/PI3K/Akt的活性，從而刺激p53 的表達(dá)，抑制cyclinD1 的表達(dá)而對(duì)A549 細(xì)胞發(fā)揮作用的。

綜上所述，蜂毒素能抑制A549 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，這種作用可能是通過(guò)調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。