吳茱萸不同提取部位致大鼠肝毒性研究

任曉靜，李 明，張 遜，馮 昊，袁金斌

（1.唐山市協(xié)和醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 063000；2.唐山市人民醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 063000；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石 虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Euodia Rutaecarpa （Juss.）Benth.var.bodinier（Dode）Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1]?，F(xiàn)代研究表明吳茱萸具有鎮(zhèn)痛[2-3]、止嘔[4-5]、抗炎、抗癌、抗增殖、抗感染、抗細(xì)菌等多種生物活性[6-7]，歷代文獻(xiàn)和2015年版《中國(guó)藥典》（一部）均記載吳茱萸“小毒”或“有毒”，吳茱萸的主要成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、和檸檬苦素等[4-6]。李文蘭等[8]研究表明，吳茱萸喹諾酮類生物堿為肝毒性主要成分，對(duì)小鼠給藥后，血清肝功能指標(biāo)和肝臟指數(shù)升高，肝臟中央靜脈及小葉下靜脈周圍肝細(xì)胞變形、灶性壞死，表明吳茱萸喹諾酮類生物堿毒性作用于肝臟。已有研究報(bào)道了吳茱萸水提物的肝毒性[9-10]、乙醇提取物的急性毒性和肝毒性作用[11]，本文對(duì)吳茱萸石油醚提取部位、正丁醇提取部位、水提取部位、氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位同時(shí)進(jìn)行大鼠肝毒性研究，確定各提取部位的毒性強(qiáng)度，為進(jìn)一步研究吳茱萸的毒性成分提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 分析天平（AE-240，北京賽多利斯儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA 公司）；AU480全自動(dòng)生化分析儀（Beckman Coulter，USA）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA-18，SIGMA 公司，德國(guó)）。

1.2 試藥 吳茱萸藥材采集于江西新干縣淦川鎮(zhèn)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)楊武亮教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的干燥近成熟果實(shí)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)：20150418）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)：20150418），購(gòu)于南昌百特生物高新技術(shù)股份有限公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純（西隴化工）；水為重蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD 大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，清潔級(jí)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，自然照明，正常飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 吳茱萸不同提取物浸膏制備 采用加熱回流提取法，選取一定量吳茱萸藥材，經(jīng)烘干、粉碎，過(guò)三號(hào)篩備用，稱取2.5 kg 吳茱萸藥材粉末，加入20 L75%乙醇，加熱回流1.5 h，按此方案再提取1次，時(shí)間1.0 h，將2 次提取液過(guò)濾，合并。剩余的殘?jiān)?0 倍量蒸餾水煎煮1.0 h，收集上層溶液后繼續(xù)用蒸餾水煎煮0.5 h，水提取物合并過(guò)濾。乙醇萃取液經(jīng)真空蒸餾后回收至無(wú)乙醇?xì)馕?，并與水提液混合，濃縮干燥后得到吳茱萸浸膏，再用蒸餾水稀釋，最后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，重復(fù)3～5 次，將各溶劑萃取液合并一起，得到5 種不同的提取部位溶液，回流濃縮萃取液，冷凍干燥，得5種不同提取部位浸膏，密封放置冰箱中保存，以備不同提取部位的毒性實(shí)驗(yàn)用。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 隨機(jī)挑選SD 大鼠160 只，雌雄各半，按隨機(jī)分配法分為正常組1 組，實(shí)驗(yàn)組5 組，每組10 只，實(shí)驗(yàn)組包括石油醚提取部位、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位以及水提取部位的低、中、高3 個(gè)劑量組。以吳茱萸臨床常用劑量為依據(jù)，按成人（60 kg）處方日用量（10 g）的臨床等效量的1、2、4 倍設(shè)計(jì)，設(shè)定高、中、低劑量分別為3.46、1.73、0.87 g/kg，均按25 mL/kg 計(jì)算給藥體積，給藥組每天按時(shí)給予一定劑量的藥物，對(duì)照組給予等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間主要觀察大鼠的活動(dòng)情況，毛色變化以及飲食情況，并記錄。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 最后1 次給藥前12 h 禁食，正常飲水，各劑量組大鼠灌胃給藥，2 h 后取大鼠眼球靜脈血，靜置30 min 后離心，取上層血清，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定ALT、AST 活性。

2.4 組織病理學(xué)檢查 大鼠取血后立即解剖大鼠，取大鼠肝臟，將周圍結(jié)締組織剔除后放入生理鹽水中漂洗，然后用濾紙拭干表面液體，稱重并計(jì)算其肝臟指數(shù)（肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%；另取肝臟右葉，以10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，用常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)7 d 內(nèi)，對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常、毛色光亮、飲水飲食均正常，無(wú)死亡。觀察吳茱萸不同提取部位各劑量組大鼠，癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、不活潑，毛色暗淡，進(jìn)食飲水不良。稱量大鼠體質(zhì)量，各劑量組大鼠生長(zhǎng)緩慢，同對(duì)照組比較，給藥7 d 后乙酸乙酯、正丁醇各劑量組和水部位高劑量出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大鼠體質(zhì)量信息見(jiàn)表1。

3.2 對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 對(duì)照組大鼠血清AST、ALT 數(shù)值均處于正常范圍內(nèi)。而吳茱萸不同提取部位的各劑量組血清AST、ALT 內(nèi)水平均顯著升高，與對(duì)照組數(shù)據(jù)相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01），其中石油醚提取部位高、中、低劑量組的AST、ALT 水平提高最為顯著，其次依次為正丁醇提取部位、水提取部位、氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 吳茱萸不同提取部位對(duì)大鼠體質(zhì)量變化的影響（，n=10）

表1 吳茱萸不同提取部位對(duì)大鼠體質(zhì)量變化的影響（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 吳茱萸不同提取部位對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（，n=10）

表2 吳茱萸不同提取部位對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.3 吳茱萸不同提取部位肝臟器指數(shù)檢測(cè) 吳茱萸不同提取部位各劑量組均可導(dǎo)致肝/體比值增加，除石油醚低劑量組、氯仿低劑量組和正丁醇低劑量組外，其余各劑量組與對(duì)照組比較，呈現(xiàn)極顯著性差異和顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），且隨著劑量增大，肝/體比值逐漸增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 吳茱萸不同提取部位對(duì)大鼠肝臟器指數(shù)的影響（，n=10）

表3 吳茱萸不同提取部位對(duì)大鼠肝臟器指數(shù)的影響（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.4 對(duì)大鼠肝臟病理學(xué)影響 光鏡下組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝臟無(wú)異常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完好，肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯變性、壞死，肝竇未見(jiàn)明顯瘀血擴(kuò)張，實(shí)驗(yàn)組中吳茱萸不同提取部位低、中劑量組的大鼠肝臟損傷未見(jiàn)明顯異常，而高劑量組的大鼠肝臟出現(xiàn)不同程度損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，且有少部分可見(jiàn)小灶性或單細(xì)胞壞死，壞死細(xì)胞彌漫性存在于肝小葉中央，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肝臟病理學(xué)切片結(jié)果

4 討論

肝臟作為動(dòng)物體重要的代謝器官，承擔(dān)著機(jī)體重要的生理功能。容易受到外界因素的入侵而受損，肝臟的損傷主要分為暴力性肝損傷（如物理性損傷）和病理性損傷（包括化學(xué)性、藥物性及酒精性肝損傷等），臨床上血清中ALT、AST 的水平是檢查肝損傷程度的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)吳茱萸不同提取部位均進(jìn)行了肝毒性研究，以臨床劑量下給大鼠灌服吳茱萸不同極性提取物，以ALT、AST 水平來(lái)衡量大鼠肝損傷大小，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析后對(duì)吳茱萸的肝毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)對(duì)大鼠肝臟器指數(shù)的分析，結(jié)合肝臟切片的組織病理學(xué)檢查，來(lái)評(píng)價(jià)吳茱萸各提取物對(duì)大鼠肝臟的損傷。生化指標(biāo)結(jié)果得出，吳茱萸不同溶劑提取部位都顯示有肝毒性，5個(gè)不同提取部位對(duì)大鼠肝毒性強(qiáng)度為：石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位＞氯仿部位＞乙酸乙酯部位。肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量組的大鼠肝臟出現(xiàn)不同程度損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，且有少部分可見(jiàn)小灶性或單細(xì)胞壞死，壞死細(xì)胞彌漫性存在于肝小葉中央，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明吳茱萸具有肝毒性。

吳茱萸主要化學(xué)成分為生物堿類物質(zhì)、檸檬苦素類物質(zhì)和揮發(fā)油類物質(zhì)。有研究表明[8]，吳茱萸中喹諾酮類生物堿為主要肝毒性物質(zhì)，由于石油醚提取物中喹諾酮生物堿含量較高，所以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了石油醚提取部位肝毒性最強(qiáng)。臨床上吳茱萸多以水煎液為藥用劑型，用量因毒性受到限制，所以確定吳茱萸水提部位也具有毒性。吳茱萸毒性成分種類不明確，且各成分的毒性強(qiáng)度又有所不同，體現(xiàn)出吳茱萸各提取物均具有一定毒性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)吳茱萸不同提取部位肝毒性考察，提供了吳茱萸肝毒性物質(zhì)的基本信息，從而能進(jìn)一步探求吳茱萸毒性成分，為吳茱萸中醫(yī)臨床安全有效用藥提供科學(xué)依據(jù)，為同類有毒中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了思路。