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    白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126和caspase-3的表達(dá)關(guān)系及意義

    2020-06-05 02:16:26程麗娜閆春妮宋蔚
    河北醫(yī)藥 2020年10期
    關(guān)鍵詞:晶狀體白內(nèi)障蛋白

    程麗娜 閆春妮 宋蔚

    白內(nèi)障是由遺傳、免疫及外部傷害等其他先天性或后天性因素導(dǎo)致的一種眼部疾病。臨床主要表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)、晶狀體渾濁、視物不清晰等,常發(fā)生于40歲以上人群,發(fā)病率隨年齡增大而升高。據(jù)報道全球因白內(nèi)障致盲的人數(shù)占40%以上[1],其中約一半病例發(fā)生在亞洲等發(fā)展中國家,視力損害給患者生活造成極大不便,但白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。因此,不斷尋找有效的診斷指標(biāo),探求白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理對病情防治十分重要。研究表明白內(nèi)障發(fā)病的首要環(huán)節(jié)是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)miR-125、miR-181及miR-126等多種miRNA能夠通過調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,影響白內(nèi)障進(jìn)程[2],caspase-3是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)節(jié)因子,其表達(dá)量一定程度上可以反映出凋亡發(fā)生情況[3]。筆者查閱發(fā)現(xiàn)對于miR-126與caspase-3在白內(nèi)障疾病中作用及二者與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系鮮有報道。本研究擬通過檢測白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)情況,分析二者與白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的聯(lián)系,旨在探討二者在白內(nèi)障疾病發(fā)生中作用。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2017年5月至2018年6月本院收治的78例白內(nèi)障患者為觀察組,其中男37例43眼,女41例46眼;年齡45~76歲,平均年齡(61.24±5.36)歲;同期選取52例正常人(角膜移植術(shù)供體)為對照組,男24例24眼,女28例28眼;年齡45~75歲,平均年齡(60.12±4.95)歲。2組研究對象一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 白內(nèi)障患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)確診符合白內(nèi)障診斷標(biāo)準(zhǔn)[4];(2)患者均對本研究知情,并簽署知情同意書;(3)角膜散光<1.00D。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并青光眼、視神經(jīng)炎及其他眼底疾病;(2)合并高血壓、糖尿病及其他繼發(fā)性視力減退疾病;(3)自身免疫疾病、精神疾病及感染性疾病。

    1.3 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒:購自于賽默飛世爾科技公司;SYBR?Green Kit:購自上海翊圣生物科技有限公司;引物:由南京科佰生物科技有限公司合成;多功能酶標(biāo)儀、qRT-PCR儀:購自美國Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀:購自艾森生物科技有限公司。

    1.4 研究方法

    1.4.1 樣品采集與保存:采用超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù),收集患者晶狀體上皮細(xì)胞樣本,培養(yǎng)于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

    1.4.2 晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3水平:收集晶狀體上皮細(xì)胞,采用RNA提取試劑盒提取晶狀體上皮細(xì)胞中總RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀分別對miR-126、caspase-3進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR分別采用SYBR?Green Kit試劑盒,反應(yīng)體系均為10 μl,具體步驟參見說明書;miR-126反應(yīng)條件:95℃:40 s;95℃:10 s;55℃:30 s,共40Cyc;caspase-3反應(yīng)條件:94℃:30 s;55℃:45 s;72℃:45 s,共30Cyc。miR-126及內(nèi)參U6、caspase-3及內(nèi)參β-actin的引物序列見下表。采用2-ΔΔCT法對miR-126、caspase-3表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。見表1。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.4.3 晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平:Western blotting法測定晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平,加入裂解液靜置40 min后,12 000 r/min離心30 min,取上清,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,再轉(zhuǎn)移至PVDF薄膜上,加入一抗(anti-caspase-3)4℃孵育過夜,加入HRP標(biāo)記的IgG二抗稀釋液室溫孵育2 h后,以β-actin為內(nèi)參,進(jìn)行拍照并計算caspase-3/β-actin值。每個樣品測定3次,取平均數(shù)。

    1.4.4 晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的測定:使用胰蛋白酶處理各樣本培養(yǎng)細(xì)胞,磷酸緩沖液洗滌后,離心10 min(2 000 r/min),棄上清,將細(xì)胞濃度調(diào)至100 000/ml,滴加雙染劑靜置20 min后,轉(zhuǎn)至冰上,分別加500 μl結(jié)合緩沖液,混合均勻,放入流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3 mRNA水平比較 觀察組患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126水平顯著高于對照組,caspase-3 mRNA水平顯著高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 正常對照組及觀察組晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、Caspase-3 mRNA水平比較

    2.2 晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白水平比較 觀察組白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞caspase-3蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1,表3。

    圖1 Western印跡觀察晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)情況

    2.3 晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率比較 觀察組白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。見表4。

    表3 正常對照組及觀察組晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白水平比較

    表4 正常對照組及白內(nèi)障觀察組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率比較

    2.4 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率均呈顯著正相關(guān)(r=0.669,P<0.05;r=0.633,P<0.05)。見圖2、3。

    圖2 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126表達(dá)及其凋亡率的相關(guān)性分析

    圖3 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3表達(dá)及其凋亡率的相關(guān)性分析

    2.5 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)的相關(guān)性 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126水平與caspase-3表達(dá)水平顯著正相關(guān)(r=0.599,P<0.05)。見圖4。

    圖4 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126與caspase-3表達(dá)的相關(guān)性分析

    3 討論

    白內(nèi)障是晶狀體衰老造成的,晶狀體是眼內(nèi)一個無血管組織,具有屈光作用,能夠使眼球視物的焦點落到視網(wǎng)膜上。晶狀體由晶狀體囊及晶狀體纖維組成,在晶狀體與晶狀體囊之間有一單層上皮細(xì)胞即晶狀體上皮細(xì)胞,能夠分化成為晶狀體纖維,是晶狀體代謝活躍的細(xì)胞,上皮細(xì)胞的活性對晶狀體生長、分化、維持晶狀體的透明性及修復(fù)損傷有著至關(guān)重要的作用。研究表明,外部損傷、年齡老化及免疫代謝等均會使晶狀體上皮細(xì)胞活性降低,抗氧化能力下降,晶狀體內(nèi)自由基含量隨之上升,使得晶狀體受到氧化損傷,影響晶狀體的正常代謝及其他生理功能,導(dǎo)致晶狀體渾濁,引發(fā)白內(nèi)障,但其具體機(jī)制仍未明確[5]。隨著白內(nèi)障患病率逐年上升,尤其在亞洲等發(fā)展中國家現(xiàn)象更為明顯,給社會造成極大負(fù)擔(dān),因此探尋白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制,對診斷白內(nèi)障疾病進(jìn)程具有重要意義。

    微小RNA(miRNA)是一類單鏈小分子非編碼RNA,具有負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的功能[6]。研究表明,miRNAs在眼部功能方面具有重要調(diào)控作用,影響晶狀體細(xì)胞增殖、分化、衰老等過程,與白內(nèi)障等疾病進(jìn)程密切相關(guān)[7]。已報道的miRNAs有miR-34、miR-125、miR-181、miR-184及miR-126等。季青山等[8]探究了miR-34a/SIRT1在H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷可引起miR-34a表達(dá)水平上調(diào),SIRT1表達(dá)水平下調(diào)。孫根柱等[9]研究表明miR-125a-3p在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中表達(dá)是下調(diào)的??赡芘c白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。秦宇等[10]探討了miR-181調(diào)控白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制,結(jié)果表明miR-181能促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,可能為白內(nèi)障非手術(shù)治療提供新途徑。丁芝祥等[11]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時,細(xì)胞內(nèi)miR-184表達(dá)上調(diào),且表達(dá)水平與誘導(dǎo)濃度及時間有關(guān)。汪靜[12]探究了miR-126表達(dá)水平對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126可能通過調(diào)控HLEB3凋亡,從而在白內(nèi)障治療中發(fā)揮作用。與過往研究一致的是,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126水平表達(dá)量較正常人顯著上調(diào),提示miR-126可能與白內(nèi)障的發(fā)病相關(guān)。

    目前研究認(rèn)為,白內(nèi)障發(fā)病的首要環(huán)節(jié)是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體內(nèi)代謝最活躍的部位,它的凋亡會導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞密度降低,從而使晶狀體的正常生長受到影響[13]。此外晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)含有大量酶系統(tǒng),具有抗晶狀體氧化損傷、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。因此,晶狀體上皮細(xì)胞對于維持晶狀體透明十分重要。本研究發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率高于正常人,提示晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率可能與白內(nèi)障疾病的發(fā)展相關(guān)。caspase-3是caspases半胱氨酸蛋白酶家族中的一員,又叫“殺手蛋白”,近年來研究人員發(fā)現(xiàn)caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的終末蛋白,在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用,細(xì)胞經(jīng)紫外線等物理、化學(xué)因素刺激后,caspase-3被激活,可使細(xì)胞中的細(xì)胞骨架等蛋白質(zhì)成分降解,從而發(fā)生細(xì)胞凋亡[14]。研究表明,caspase-3能夠降解晶狀體連接蛋白,提示caspase-3的表達(dá)可能參與了白內(nèi)障的形成[15]。鄭華峰等[16]研究了miR-126在大鼠心肌缺血再灌注早期的表達(dá)及作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126的與caspase-3的激活有關(guān),從而影響了缺血心肌細(xì)胞的凋亡。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)caspase-3與TUG1均為miR-421的直接靶標(biāo),通過miR-421/caspase-3靶向調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。這與本實驗有著相似之處,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3 mRNA和蛋白水平均顯著高于對照組,與李延輝等[18]人對于老年性白內(nèi)障狀體上皮細(xì)胞凋亡及Caspase-3的表達(dá)情況研究一致,提示晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及caspase-3的表達(dá)與白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示,白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3水平與細(xì)胞凋亡率顯著正相關(guān),miR-126水平與caspase-3表達(dá)水平亦呈顯著正相關(guān)。提示miR-126與caspase-3可能通過某種機(jī)制共同參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而影響白內(nèi)障疾病的發(fā)生及發(fā)展。

    綜上所述miR-126、caspase-3在白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中高表達(dá),與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡有關(guān),提示二者可能通過調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程,參與白內(nèi)障發(fā)病過程調(diào)控。

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