黃芪提取物對(duì)心肌梗死大鼠血清cTnI、TGF-β1的影響

張建新 胡大軍 杜巍 鐘敏

心肌梗死具有發(fā)病率高、病死率高、病情進(jìn)展快和預(yù)后差的特點(diǎn)，臨床治療主要是通過(guò)縮小心肌梗死的面積，降低機(jī)體心肌受損的程度，從而使心肌梗死導(dǎo)致的死亡率降低，但治療效果并不是很理想[1]。黃芪作藥用在我國(guó)已有兩千多年的歷史，對(duì)陽(yáng)氣虛弱、氣虛乏力、陰虛盜汗等癥狀具有一定的治療價(jià)值[2]。cTnI是能夠反映心肌損傷和心肌細(xì)胞壞死的一種標(biāo)志物，屬于心肌的特異性蛋白，主要的存在場(chǎng)所是心肌收縮蛋白肌絲中，在心肌的收縮和舒張中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3]。TGF-β1是一種十分關(guān)鍵的促纖維化生長(zhǎng)因子，在機(jī)體心肌重構(gòu)以及纖維化形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。本文研究中設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，使用黃芪提取物對(duì)心肌梗死模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在探究其對(duì)心肌梗死模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)cTnI、TGF-β1水平的影響。

1 材料與方法

1.1 研究動(dòng)物 選取30只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，年齡3～6個(gè)月，平均年齡(4.0±1.5)月，體重200～248 g，平均體重(219±7.8)g。所有大鼠養(yǎng)殖在干凈籠子內(nèi)，室溫保持在(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天保持12 h光照，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1周。本文研究所做實(shí)驗(yàn)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 黃芪提取物(天根生化科技有限公司)；兔抗大鼠cTnI、TGF-β1抗體(Sigma公司)兔抗小鼠p-AKT抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2、Bax抗體(Hyclone公司)；ELISA試劑盒(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；HE染色劑、PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建模及處理：隨機(jī)選取10只大鼠作為正常組，不做任何處理。對(duì)剩余20只大鼠進(jìn)行心肌梗死模型建立：使用濃度為1%的40 mg/kg戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，使用碘酒消毒后將背位固定，切開(kāi)喉管插入氣管，與呼吸機(jī)連接，在大鼠左胸第3和4段肋骨之間用剪刀橫切，再用鑷子進(jìn)行分離后打開(kāi)胸腔，使心臟充分暴露。將心包膜剪開(kāi)，使用無(wú)創(chuàng)興5-0號(hào)縫線將冠狀動(dòng)脈前支進(jìn)行結(jié)扎，待心臟搏動(dòng)減弱，Ⅱ?qū)?lián)心電圖開(kāi)始變化，ST段出現(xiàn)明顯上抬，直到抬高到弓背向上，即為造模成功。最終建模成功18只，將18只心肌梗死模型大鼠隨機(jī)分為心肌梗死組、黃芪干預(yù)組，每組9只。對(duì)黃芪干預(yù)組模型大鼠使用黃芪提取物進(jìn)行灌胃處理，劑量為40 mg/kg，正常組與心肌梗死組大鼠使用等量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃處理。對(duì)3組大鼠均連續(xù)干預(yù)4周，觀察效果。

1.3.2 心功能指標(biāo)檢測(cè)：使用10%的水合氯醛溶液(0.3 ml/kg)對(duì)所有大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射、麻醉，使大鼠保持仰臥位并進(jìn)行固定、剃毛。將大鼠的軀體向左傾斜30°左右，并將多普勒超聲檢測(cè)儀探頭置于大鼠胸骨的左側(cè)，使探頭與大鼠胸骨中線部位保持10°～30°夾角。檢測(cè)指標(biāo)包括舒張末期左心室后壁厚度(LVPWDd)、舒張末期室間隔厚度(IVSDd)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)，并對(duì)左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)以及左心室短軸縮短率(FS)進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 HE染色處理：3組大鼠全麻，采用斷頭法處死，取心尖部心肌組織，液氮冷凍后用甲醛浸泡固定，然后進(jìn)行組織切片。對(duì)3組大鼠切片樣本進(jìn)行染色處理，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理2次，每次5 min，然后在梯度乙醇下水花處理3 min，自來(lái)水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸乙醇分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍(lán)處理2 min，自來(lái)水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10 min，自來(lái)水沖洗1次；使用乙醇梯度進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像分析。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)cTnI、TGF-β1水平：采用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度10～20 μg/ml，在96孔酶標(biāo)板中加入100 μl/孔，4℃過(guò)夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的150 μl BSA，在37℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μl,稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次后，使用顯色劑顯色20 min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。

1.3.5 Western blot法檢測(cè)p-AKT、Bcl-2及Bax相對(duì)表達(dá)量：將采集到的標(biāo)本，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，通過(guò)10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按1∶1 000稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4℃的環(huán)境下孵育過(guò)夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其浸在底物溶液中進(jìn)行顯色，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)目的蛋白灰度值進(jìn)行分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心肌病理組織學(xué)觀察 對(duì)3組大鼠心肌組織病理組織圖進(jìn)行觀察?？梢?jiàn)正常組大鼠心肌結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列整齊且胞質(zhì)豐富均勻，細(xì)胞間隙正常，未發(fā)現(xiàn)心肌纖維破壞現(xiàn)象；心肌梗死組大鼠可見(jiàn)多數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)出大面積局灶性梗死瘢痕，心肌纖維斷裂；黃芪干預(yù)組大鼠局灶性梗死瘢痕面積縮小，心肌纖維數(shù)量增多，心肌損傷獲得改善。見(jiàn)圖1。

2.2 3組大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)比較 心肌梗死組大鼠心功能指標(biāo)LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd均顯著高于正常組，黃芪干預(yù)組大鼠心功能指標(biāo)LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd均顯著低于心肌梗死組，高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；心肌梗死組大鼠心功能指標(biāo)EF、FS水平均低于正常組，黃芪干預(yù)組大鼠心功能指標(biāo)EF、FS水平均高于心肌梗死組，低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 3組大鼠心肌組織病理組織學(xué)觀察(HE×200)

表1 3組大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與心肌梗死組比較，#P<0.05

2.3 3組大鼠心肌組織cTnI、TGF-β1水平比較 心肌梗死組大鼠心肌組織cTnI、TGF-β1水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪干預(yù)組大鼠心肌組織cTnI、TGF-β1水平均高于正常組，低于心肌梗死組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠心肌組織cTnI、TGF-β1水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與心肌梗死組比較，#P<0.05

2.4 3組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-AKT、Bcl-2及Bax相對(duì)表達(dá)量比較 心肌梗死組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-AKT、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均顯著高于正常組，Bax相對(duì)表達(dá)量低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪干預(yù)組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-AKT、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均顯著高于正常組，低于心肌梗死組，Bax相對(duì)表達(dá)量低于正常組，高于心肌梗死組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-AKT、Bcl-2及Bax相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與心肌梗死組比較，#P<0.05

3 討論

臨床醫(yī)學(xué)中將冠狀動(dòng)脈缺血、缺氧而導(dǎo)致的心肌壞死癥狀稱為心肌梗死[5]。心肌梗死癥狀的主要臨床表現(xiàn)為胸骨后疼痛，且疼痛感劇烈持久，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響，且心肌梗死癥狀很有可能會(huì)并發(fā)心律失常、心力衰竭等癥狀，對(duì)患者的生命安全造成嚴(yán)重的威脅[6-8]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)每年約新增心肌梗死患者60萬(wàn)左右，因此對(duì)心肌梗死癥狀進(jìn)行及時(shí)有效的治療具有重要意義[9]。

目前臨床較為常用的治療心肌梗死的方法主要包括心肌再灌注治療、溶栓治療、抗凝和抗血小板治療以及冠脈搭橋術(shù)治療等，主要是通過(guò)縮小心肌梗死的面積，降低機(jī)體心肌受損的程度，從而使心肌梗死導(dǎo)致的死亡率降低，但是治療的效果并不是很理想[10,11]。目前臨床治療心肌梗死主要使用西藥，中藥的應(yīng)用范圍相對(duì)較小，關(guān)于中藥對(duì)心肌梗死癥狀治療效果的研究也較少，本文研究中設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，使用黃芪提取物過(guò)心肌梗死模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在探究其應(yīng)用價(jià)值。

我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心肌梗死屬于胸瘦心痛范疇，是由于寒邪、正氣虧虛等引起，心肌梗死患者常伴有呼吸不暢、心掙、氣短、喘促、面色蒼白、驚恐不安以及冷汗自出等[12]。黃芪作藥用在我國(guó)已有兩千多年的歷史，許多專家學(xué)者對(duì)黃芪的藥用價(jià)值進(jìn)行深入研究，表明黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿生肌等作用，對(duì)陽(yáng)氣虛弱、氣虛乏力、陰虛盜汗等癥狀有治療價(jià)值[13]。LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd、EF、FS是臨床較為常用的評(píng)價(jià)機(jī)體心功能的指標(biāo)，對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，能夠較為直觀的反映機(jī)體心功能情況[14]。本文研究中對(duì)大鼠心功能指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，心肌梗死模型大鼠LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd、EF、FS水平相較于正常大鼠出現(xiàn)了明顯的異常，使用黃芪提取物進(jìn)行干預(yù)后，心肌梗死大鼠心功能指標(biāo)水平均受到明顯調(diào)控而趨近于正常水平，說(shuō)明使用黃芪提取物能夠一定程度上對(duì)大鼠心功能進(jìn)行改善。

cTnI是能夠反映心肌損傷和心肌細(xì)胞壞死的一種標(biāo)志物，因?yàn)樾募p傷在前期能夠很快被釋放，所以在血液中的表達(dá)不受其他因素影響[15]。cTnI在心肌損傷診斷中具有高特異性和高敏感性，正常人血液中的cTnI水平很低，但是一旦有炎性反應(yīng)的發(fā)生，表達(dá)水平就會(huì)明顯上升。相關(guān)報(bào)道指出，在還未成熟骨骼肌中能夠檢測(cè)到cTnT，說(shuō)明cTnT不是心肌的特異性蛋白，而cTnI屬于心肌的特異性蛋白，主要的存在場(chǎng)所是心肌收縮蛋白肌絲中，在心肌的收縮和舒張中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。TGF-β1是一種十分關(guān)鍵的促纖維化生長(zhǎng)因子，在機(jī)體心肌重構(gòu)以及纖維化形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[16]。韓素霞等[17]在其研究中表明，TGF-β1能夠參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成、心室重構(gòu)等過(guò)程，在機(jī)體心肌梗死后心室重構(gòu)過(guò)程起到關(guān)鍵作用。本文研究結(jié)果顯示，使用黃芪提取物對(duì)心肌梗死模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠心肌組織cTnI、TGF-β1水平受到調(diào)控而趨近于正常水平，說(shuō)明黃芪提取物能夠減輕機(jī)體心肌損傷程度，促進(jìn)機(jī)體心室重構(gòu)。

心肌梗死癥狀常伴隨著心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷程度[18]。Bcl-2和Bax蛋白都屬于Bcl-2基因家族，是兩種標(biāo)志性的凋亡蛋白。在功能區(qū)分上，Bcl-2是一種凋亡抑制基因，而B(niǎo)ax則是一種凋亡誘導(dǎo)基因，他們能夠在決定細(xì)胞死亡和生存等問(wèn)題上起著至關(guān)重要的作用。在發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡功能的時(shí)候，Bcl-2與Bax是以二聚體的形式存在，當(dāng)Bcl-2與Bax形成二聚體后，Bcl-2的凋亡抑制作用便會(huì)消失，從而會(huì)引起細(xì)胞凋亡情況的發(fā)生。有研究表明，Bcl-2與Bax蛋白能夠單獨(dú)得起到對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，在Bax不存在的時(shí)候，Bcl-2可以繼續(xù)抑制細(xì)胞的凋亡，而當(dāng)Bcl-2不存在的時(shí)候，Bax能夠繼續(xù)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[19,20]。本文研究結(jié)果顯示，使用黃芪提取物對(duì)心肌梗死大鼠進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-AKT、Bcl-2及Bax相對(duì)表達(dá)量受到了明顯的調(diào)控，說(shuō)明黃芪提取物能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷程度的作用。

綜上所述，黃芪提取物能夠有效改善心肌梗死模型大鼠的心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡，為心肌梗死癥狀的臨床治療提供了理論幫助。