熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌耐藥性的臨床價值評估

包晶晶，宋怡蒙，賀文從，劉春法，劉東鑫，趙雁林，高 飛

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學 研究生學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.北京醫(yī)院，北京 100000；3.中國疾病預防控制中心，北京 100000；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

結核?。═uberculosis，簡稱TB）是一種古老且可以廣泛傳播的慢性傳染性疾病.根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示2017年在全球范圍內(nèi)有1 000萬（范圍：900～1 110萬）新發(fā)結核病患者，每天約有4 500人死于結核?。?］.結核病已成為全球重點關注的公共健康問題之一.近年來隨著人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的感染、吸煙、糖尿病、不良生活習慣、依從性差等原因的出現(xiàn)，導致耐多藥結核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的流行與傳播日益加重，嚴重影響了結核病防控規(guī)劃的實施［2］.耐多藥結核病（MDR-TB）是指至少對異煙肼（INH）和利福平（RIF）這兩個最強有力的抗結核藥物產(chǎn)生耐藥.這些耐藥分離株的傳播在很大程度上造成難以控制的結核病流行.2018年全球新增50萬利福平耐藥結核病病例，其中78%為耐多藥結核病，中國已成為全球耐藥結核病負擔最大的三個國家之一［3］.耐多藥結核病通常需要用二線藥物進行治療，這些藥物主要包括氟喹諾酮類、氨基糖苷類注射劑.昂貴且有毒的二線藥物是對一線藥物具有耐藥性的結核分枝桿菌分離株的必然治療方法.耐多藥結核病檢出率低、難以控制，其部分原因是缺乏快速和準確的診斷測試.因此，MDR-TB和一、二線藥物耐藥性的快速診斷是目前急需解決的問題之一.熔解曲線分析是一種通過實時PCR檢測突變的簡單方法，熔解曲線技術將擴增與檢測融為一體，具有耗時短、操作簡易等優(yōu)勢，在很大程度上彌補了傳統(tǒng)藥敏檢測手段的不足，已經(jīng)成為診斷耐藥結核病的新興分子輔助技術.該方法可同時檢測一、二線抗結核藥物的耐藥性，在臨床實踐中可能是常規(guī)DST的良好替代方法［4］.異煙肼、利福平作為重要的一線藥物，其耐藥性的檢測不僅作為診斷的主要根據(jù)，也為患者的合理治療方案提供了重要保障.同時，耐多藥的出現(xiàn)使我們對二線抗結核藥物的檢測需求大大提升.本研究的目的是利用異煙肼、利福平、氟喹諾酮類、二線注射類耐藥試劑盒對215株結核分枝桿菌臨床分離株進行檢測來評估熔解曲線在臨床上的應用價值.并探索將其用作DST的測試的可能性.因此，我們評估了溶解曲線檢測一、二線抗結核藥物耐藥性的效用，并將結果與微孔板藥敏試驗結果進行比較.

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 菌株來源 2013 年黑龍江省耐藥監(jiān)測結核分枝桿菌分離株215 例及標準菌株（H37Rv）均保存于中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室菌株庫.

1.1.2 試劑與儀器 結核分枝桿菌異煙肼、利福平、氟喹諾酮、注射類二線藥試劑盒、熒光定量PCR儀均購自廈門至善生物科技有限公司；分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基（中性）購自珠海市銀科醫(yī)學工程有限公司；Middlebrook 7H9肉湯培養(yǎng)基、結核分枝桿菌藥敏板均購自美國THERMO公司；AIM全自動96孔加樣器購于thermo公司.

1.2 研究方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 用無菌吸管取菌保存液0.1 mL接種至中性改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，保持培養(yǎng)基斜面水平向上，并放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育.接種后每周觀察一次菌落生長情況，觀察后記錄觀察結果，4～6周后報告結果.

1.2.2 菌種鑒定 在1.5 mL Eppendorf 離心管中加入300 μL去離子水（HPLC 級或質(zhì)譜級），轉(zhuǎn)移分枝桿菌樣本到上述離心管中.95 ℃的金屬浴30 min 熱滅活.樣本冷卻后，加入900 μL 乙醇，用混懸器充分混勻，離心2 min（≥13 000 rpm），用移液槍小心吸棄殘余的上清液，室溫下晾干沉淀（幾分鐘即可），加入少量化鋯/二氧化硅微珠，根據(jù)沉淀的體積，加入10～50 μL乙腈，全速渦旋振蕩1 min，加入少量氧加入70%甲酸水溶液（體積與加入的乙腈體積相同），渦旋振蕩5 秒，離心2 min（≥13 000 rpm），取1 μL 上清液至MALDI靶板上，室溫晾干立即覆蓋1 μL基質(zhì)溶液，室溫晾干.將晾干的靶板放入質(zhì)譜分析儀內(nèi)進行菌種鑒定分析.

1.2.3 藥敏方法 從培養(yǎng)基上刮下菌落于含有2.5 mL生理鹽水中進行磨菌20秒.轉(zhuǎn)移120 μL混懸液至含有OADC 的7H9 藥敏接種培養(yǎng)液中.利用AIM 全自動96 孔加樣器將培養(yǎng)液分裝于結核分枝桿菌藥敏板后放入恒溫箱培養(yǎng)2周后讀取藥敏結果.菌株對藥物的MIC值大于臨界濃度，則該菌株對該藥臨界濃度表現(xiàn)為耐藥；MIC值小于或等于臨界濃度，則表明該菌株對該藥物濃度敏感.

1.2.4 熒光PCR 熔解曲線法 固體培養(yǎng)基上生長的的結核分枝桿菌用22SWG 標準接種環(huán)收集細菌1環(huán)，并懸在250 μL TB DNA提取液中，99℃加熱20 min.14 000 g離心10 min后，將5 μL上清液模板加入已配置好的PCR反應管中后進行PCR擴增和熔解曲線分析.PCR擴增區(qū)程序設定；UNG 處理：50℃2 min，1個循環(huán)；預變性：95℃5 min；Touchdown 循環(huán)：95℃10 s，71℃25 s，75℃30 s，10 個循環(huán)；PCR 循環(huán)程序：95℃10 s，61℃25 s，75℃25s，45 個循環(huán)；熔解分析程序：95℃2 min，40℃2 min，40℃～80 ℃，1 個循環(huán).檢驗結果；Tm值以儀器自動判讀所得為準，敏感型：樣品熔解曲線的熔點與陽性對照溶解曲線的熔點一致；耐藥型：樣品溶解曲線的熔點低于陽性對照2℃及以上.

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用四格表的形式計算敏感度、特異度和符合率.通過配對χ2檢驗（McNemar test）比較熒光PCR溶解曲線法與微孔板藥敏試驗（金標準）耐藥突變檢出率的差異.采用Excel表格繪制Venn Diagram.敏感度=真陽性數(shù)／（真陽性數(shù)＋假陰性數(shù)）×100%；特異度=真陰性數(shù)／（真陰性數(shù)＋假陽性數(shù)）×100%；陽性預測值=真陽性數(shù)／（真陽性數(shù)＋假陽性數(shù)）×100%；陰性預測值=真陰性數(shù)／（真陰性數(shù)＋假陰性數(shù)）×100%；陽性似然比=敏感度／（1－特異度）；陰性似然比=（1－敏感度）／特異度；符合率=（真陽性數(shù)+真陰性數(shù)）／全部檢測患者例數(shù).

2 結果

2.1 分離培養(yǎng)及菌種鑒定

215例菌株經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后無不合格或已經(jīng)死亡菌株，通過MALDI-TOF 質(zhì)譜儀匹配測得215例菌株均為結核分枝桿菌（MTB）.

2.2 藥敏試驗結果

將收集到的黑龍江省耐藥監(jiān)測結核分枝桿菌臨床分離株215例進行分離培養(yǎng)，共獲得菌株215例，經(jīng)微孔板藥敏試驗鑒定，22株為利福平耐藥菌株，42株為異煙肼耐藥菌株，10株為氧氟沙星耐藥菌株，9株為莫西沙星耐藥菌株，3株為阿米卡星耐藥菌株，5株為卡那霉素耐藥菌株.

2.3 方法學比較

以微孔板藥敏試驗為金標準，熒光PCR 熔解曲線方法檢測利福平靈敏度90.9%（20/22），特異度95.85%（185/193），符合率95.34%（205/215）；熒光PCR 溶解曲線方法檢測異煙肼的靈敏度為83.33%（35/42），特異度91.9%（159/173），符合率90.23%（194/215），其中有7例可能出現(xiàn)不均一突變，判為敏感；檢測氧氟沙星的靈敏度為90%，特異度100%，符合率99.53%；檢測莫西沙星的靈敏度為88.88%（8/9）、特異度100%（206/206）、符合率99.51%（214/215）；檢測二線注射類藥物阿米卡星的靈敏度與特異度以及符合率均為100%，而卡那霉素的敏感度為80%（4/5），特異度為100%（210/210），符合率99.53%（214/215）.表明四種試劑盒的特異性均較高，其中利福平突變檢測試劑盒的靈敏度最高.該結果表明四種試劑盒在靈敏度和特異性方面具有較好的性能.結果見表1～表6.

表1 2種方法檢測利福平耐藥結果比較Tab.1 Comparison of two methods in detecting rifampicin resistance

表2 2種方法檢測異煙肼耐藥結果比較Tab.2 Comparison of two methods in detecting isoniazid resistance

表3 2種方法檢測氧氟沙星耐藥結果比較Tab.3 Comparison of two methods in detecting ofloxacin resistance

表4 2種方法檢測莫西沙星耐藥結果比較Tab.4 Comparison of two methods in detecting moxifloxacin resistance

表5 2種方法檢測阿米卡星耐藥結果比較Tab.5 Comparison of two methods in detecting amikacin resistance

3 討論

結核病是全球單一傳染病中的頭號殺手.2018年全球3.4%新發(fā)病例為MDR/RR-TB，我國7.1%新發(fā)病例MDR/RR-TB.中國已成為全球耐多藥和廣泛耐多藥結核病高負擔國家之一［3］.近年結核病的耐藥呈不斷上升的趨勢，耐多藥患者的出現(xiàn)降低了結核病的治愈率，這對結核病的控制無疑是一場新的挑戰(zhàn).

目前，結核病的耐藥性是通過瓊脂比例法或BACTEC MGIT 960等液體培養(yǎng)基法等基于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)的方法確定的.盡管這些方法較快速，但由于結核分枝桿菌存在生長緩慢這一特性，受其影響至少需要一周以上的時間才能確定其藥敏情況.很大程度上延誤了結核病的正確治療，造成結核病的不斷傳播與發(fā)展.我國結核病患者管理主要采用DOTS策略社區(qū)（家庭）短程督導模式，但由于治療的延誤、患者依從性差或進行非連續(xù)治療、耐藥的不斷發(fā)生等原因，使得這種模式下密切接觸后感染復發(fā)的機率進一步增加.目前為止，用于治療結核病主要有效藥物是異煙肼和利福平，但是臨床上耐多藥結核病的出現(xiàn)需要使用二線抗結核藥物進行長期治療，這將會導致藥物成本高和廣泛毒性副作用的結果出現(xiàn).因此，獲得早期藥物敏感性結果對于啟動合適的結核病治療方案至關重要，結核病患者耐藥性的快速檢測有助于監(jiān)測并控制耐藥性疾病的傳播.

隨著近年結核病分子診斷技術的新興與發(fā)展，在早期快速診斷耐藥突變方面涌現(xiàn)出很多技術，目前已采用快速分子技術從臨床標本中檢測抗生素耐藥性.這些基于分子的分析可有效地用于快速鑒定抗生素耐藥性相關的基因突變和單核苷酸多態(tài)性（SNP）.分子測序具有高可靠性，但價格昂貴不能廣泛用于微生物實驗室.GeneXpert作為一種價值較高的診斷結核病的試驗方法，其自動化的設備能在短時間內(nèi)給出結果.具有潛在高通量、標準化測試、快速診斷的優(yōu)勢［5］.但該方法只能用于利福平耐藥突變的獨立診斷檢測，利福平也可作為耐藥結核病的替代參考指標，但在結核病防治領域中，檢測利福平與異煙肼的耐藥性是最低標準.因此該技術在臨床仍有較大的局限性.熒光PCR熔解曲線法是PCR技術很好的延伸，其可檢測對耐藥性標準治療方案中使用的二線抗結核藥物情況.不僅如此，其高靈敏度、低污染的特點已受到廣泛應用，熒光PCR熔解曲線技術是通過曲線形狀變化來獲得耐藥突變結果［6］.其主要檢測原理為耐藥基因突變使DNA雙鏈的結合力下降，引起相應的熔點（Tm）值下降，從而推得序列突變信息.即野生型基因有特定的熔點（Tm）值而突變型基因為結合能力下降導致Tm值發(fā)生變化，據(jù)此可以檢測出突變型和野生型結核［7］.因此，本研究的目的是分析評價熒光PCR溶解曲線技術檢測利福平、異煙肼、氟喹諾酮類及二線注射類藥物的臨床應用價值.

在過去的60 年里，世界衛(wèi)生組織（WHO）建議使用Lowenstein-Jensen（LJ）比例法已經(jīng)被廣泛使用，然而，它的主要缺點是需要4～6周獲得結果.微孔板藥敏是經(jīng)FDA認證，由美國Thermo公司生產(chǎn)的商品化藥敏板，多項研究已證實其可靠性與重復性高［8］，其是一種干燥的微型平板，含有凍干抗生素，用于檢測結核分枝桿菌菌株的最小抑制濃度（MIC）［9］.據(jù)報道，利福平、氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素和環(huán)絲氨酸與LJ比例法的臨床一致性為99.2%，異煙肼和對氨基水楊酸為98.4%［10］.微孔板藥敏法與比例法一致性很高［10］.該方法比LJ比例法更快速、方便、定量、準確地檢測一線和二線藥物［11］.并且，菌液的稀釋和接種均采用自動化儀器，很大程度減少了人為操作不穩(wěn)定性因素帶來的誤差［12］.它還提供了關于易感程度的信息，促進治療決策.在這項研究中，以微孔板藥敏試驗作為金標準，熒光PCR熔解曲線法測定的靈敏度和特異性對于利福平分別為90.9%和95.85%，對于異煙肼分別為83.33%和91.9%.熒光PCR熔解曲線先前已被其他研究人員用于檢測結核分枝桿菌分離株之間的耐藥性.我們的結果與這些研究一致.此外，我們以90%的敏感性、100%的特異性和88.88%的敏感性、100%的特異性確定了氟喹諾酮類藥物氧氟沙星與莫西沙星耐藥性.我們通過檢測gyrA 基因的88-94 突變成功檢測了10 株耐氧氟沙星的菌株中的9 株（占90%）與9株耐莫西沙星中的8株（占88.88%）.研究顯示gyrA和gyrB中的突變均引起了對氟喹諾酮類藥物的耐藥性［13］.但是，gyrB突變頻率是較低的.氟喹諾酮類藥物耐藥性主要是由于gyrA基因突變引起.因此，在無突變2 株氟喹諾酮類耐藥株可能是通過gyrB 基因突變引起的或其他機制，如主動外排泵［14］.gyrA測試的突變主要位點是gyrA88、gyrA90、gyrA91、gyrA94.臨床環(huán)境中當耐藥菌株含量較低時會出現(xiàn)同時含有突變型和野生型分離株，造成假陰性結果.此外，為檢測耐多藥和廣泛耐藥分離株，試驗還研究二線注射類藥物，即氨基糖苷類.試驗通過檢測rrs基因突變和eis基因啟動子，以分別檢測對阿米卡星和卡那霉素的耐藥性［15］.我們檢測出阿米卡星的靈敏度100%、特異度100%、檢測卡那霉素的靈敏度80%、特異度100%.由于二線注射類藥物耐藥性較低，我們在215株結核分枝桿菌臨床分離株中共檢測出7株耐氨基糖苷類分離株.試驗成功檢測了5株耐卡那霉素的菌株中的4株（占80%）.很少有方法可以檢測出eis基因啟動子中的突變來檢測對卡那霉素的低水平耐藥性.應評估更多分離株以驗證熒光PCR對二線注射類藥物測定的有效性.

研究提示，熒光PCR熔解曲線為耐藥結核分枝桿菌菌株的突變提供了幫助，其低成本與使用靈活的特點可廣泛用于流行病學研究.熒光PCR熔解曲線可以快速同時檢測出對一線和二線抗結核藥物的耐藥性，并消除了通過表型藥物敏感實驗獲得結果所需的延長周期［6］.但是，溶解曲線也存在局限性，該方法篩選中不包含氨基酸序列，這會導致不引起氨基酸改變的沉默突變也會歸為突變一類，如本試驗顯示的微孔板藥敏結果為敏感但熔解曲線檢測為耐藥突變，此外若不均一耐藥菌株中耐藥菌的比例偏低時，可能會導致溶解峰與陽性對照一致判定為敏感，造成假陰性結果［16］.

綜上所述，熒光PCR熔解曲線分析技術是一種簡單快速、準確且具有成本效益的方法.在檢測異煙肼、利福平、氟喹諾酮類、二線注射類藥物耐藥上具有較高的靈敏度和特異度.此方法與表型DST方法相比在短時間內(nèi)產(chǎn)生結果，可以及時進行治療并預防可能的耐多藥菌株的出現(xiàn)，有效的輔助耐藥結核分枝桿菌快速診斷篩查.