基于高通量測序技術(shù)研究藥食兩用薏苡仁中污染真菌多樣性

郭夢月 姜汶君 于景盛

摘要 目的：調(diào)查藥食兩用薏苡仁中污染真菌多樣性，為其安全使用提供參考依據(jù)。方法：收集薏苡仁樣品18批，提取真菌DNA并擴增ITS2序列，基于Illumina MiSeq PE250平臺進行高通量測序。結(jié)果：共檢測到4門18綱44目99科149屬的真菌，子囊菌門Ascomycota是最優(yōu)勢菌門，鐮刀菌屬Fusarium（3.05%～60.32%）是屬水平最優(yōu)勢屬，其次是曲霉屬Aspergillus（2.20%～45.44%）、白僵菌屬Beauveria（0.07%～63.21%）、鏈格孢屬Alternaria（0.80%～11.92%）、Arachnomyces（0.03%～39.36%）和青霉屬Penicillium（0.24%～8.03%）。此外，共檢測到5種潛在產(chǎn)毒真菌，分別是煙曲霉A.fumigatus、土曲霉A.terreus、梨孢鐮刀菌F.poae、囊狀青霉P.capsulatum和展青霉P.paxilli。結(jié)論：高通量測序技術(shù)可以快速有效地檢測薏苡仁中污染真菌種類，為薏苡仁污染真菌毒素提供風(fēng)險預(yù)警。

關(guān)鍵詞 薏苡仁;真菌多樣性;高通量測序;藥食兩用;ITS2;產(chǎn)毒真菌;真菌鑒定;鐮刀菌屬

Abstract Objective：To investigate the fungal diversity in medicinal and edible Coicis Semen，thus providing evidence for its safe use.Methods：A total of 18 batches of Coicis Semen samples were collected.The total DNA was extracted，and the ITS2 sequences were amplified.Then，the amplicons were sequenced using the Illumina MiSeq PE250 platform.Results：The fungi detected were denominated to 4 phylum，18 class，44 orders，99 families，and 149 genera.Ascomycota was the dominant fungus at the phylum level.At the genus level，F(xiàn)usarium was the most predominant，followed by Aspergillus，Beauveria，Alternaria，Arachnomyces and Penicillium，accounting for （3.05%～60.32%），（2.20%～45.44%），（0.07%～63.21%），（0.80%～11.92%），（0.03%～39.36%） and （0.24%～8.03%）.In addition，a total of 5 potential mycotoxin-producing fungi were detected，namely，A.fumigatus，A.terreus，F(xiàn).poae，P.capsulatum and P.paxillin.Conclusion：High-throughput sequencing technology can quickly and effectively detect fungal contamination in Coicis Semen，thereby providing early warning for mycotoxin contamination in Coicis Semen.

Keywords Coicis Semen; Fungal diversity; High-throughput sequencing; Medicinal and edible; ITS2; Mycotoxin-producing fungi; Fungal identification; Fusarium

禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen（Roman.）Stapf在我國分布廣泛，資源豐富，是重要的藥食兩用作物。其成熟種仁不僅是營養(yǎng)價值極高的食品，也是藥用歷史悠久的中藥材。薏苡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版記載其具有利水滲濕、健脾止瀉等作用[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-5]表明其具有抗腫瘤、增強機體免疫功能、降血糖等作用。薏苡仁在采收、加工、運輸和貯藏等多個環(huán)節(jié)中都容易污染真菌，其含有的脂肪酸等物質(zhì)為真菌的生長和繁殖提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。在適當?shù)臈l件下，污染的潛在產(chǎn)毒真菌還會產(chǎn)生真菌毒素。近年來，中藥材中污染真菌被頻頻報道，已成為威脅藥材安全使用的重要因素[6-7]。目前，《中國藥典》2015年版對薏苡仁中污染黃曲霉毒素進行了限量[1]，薏苡仁中檢測到黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮已有報道[8-9]。因此，對薏苡仁中污染真菌進行快速準確鑒定可以為其污染真菌毒素進行風(fēng)險預(yù)警。

近年來，高通量測序技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性研究已成為熱點[10]。高通量測序技術(shù)可以克服傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法中部分菌株不能分離培養(yǎng)、耗時繁雜等缺陷，更加全面地反映真菌群落的多樣性。本研究采用高通量測序技術(shù)對18批薏苡仁藥材中污染真菌進行了調(diào)查，為其安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料

從不同藥店共收集薏苡仁樣品18批，分別產(chǎn)自四川、貴州、安徽、云南、黑龍江和福建6個省，見表1，根據(jù)產(chǎn)地信息將其分為6組。

2 方法

2.1 DNA提取 稱取薏苡仁樣品5 g于15 mL離心管中，加入10 mL無菌水，渦旋振搖20 min，用單層無菌紗布進行過濾，濾液用高速冷凍離心機（Eppendorf公司，德國，型號：5430R）7 830 r/min振搖15 min獲得微生物。根據(jù)EZNA土壤DNA提取試劑盒（Omega公司，美國，型號：D5625-01）說明書提取微生物總DNA。

2.2 PCR擴增和高通量測序 提取到的DNA經(jīng)檢驗合格后，擴增真菌ITS2序列，引物為ITS3（5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[11]。PCR擴增程序如下：95 ℃變性5 min;再進行35個循環(huán)（95 ℃變性45 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s）;最后72 ℃延伸10 min。將同一樣本3個重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司，美國）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。Illumina MiSeq PE250高通量測序委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

2.3 數(shù)據(jù)分析 使用Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME，Version 1.8，http：//qiime.org）軟件對測得的fq數(shù)據(jù)進行過濾處理[12]。過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的read;然后根據(jù)雙端測序的overlap關(guān)系將成對的序列拼接成一條序列，最小overlap長度為10 bp。使用UPARSE（Version 7.1，http：//drive5.com/uparse/）[13]根據(jù)97%的相似度水平對所有序列進行OTU劃分，使用USEARCH（Version 8.1.1861，Http：//Www.Drive5.Com/Usearch/）[14]除去嵌合體?；赨NITE數(shù)據(jù)庫[15]在界、門、綱、目、科、屬和種水平注釋其群落的物種信息，剔除非真菌OTU。基于OTU聚類結(jié)果利用mothur[16]進行稀釋性曲線（Rarefaction Curve）分析，利用R語言工具制作曲線圖。使用Chao 1、Shannon指數(shù)、Observed_species和Goods_coverage來估計群落的Alpha多樣性。基于主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）闡明不同樣本組成的相似性。通過Spearman檢驗方法，選取所有樣本絕對豐度前20的OTU進行與門水平注釋結(jié)果相互關(guān)聯(lián)性分析。

3 結(jié)果

3.1 薏苡仁中真菌多樣性分析 在質(zhì)控后共獲得2 113 891條優(yōu)質(zhì)的ITS2序列，序列長度為200～460 bp。抽平分析后，每個樣本包括17 269條序列，共產(chǎn)生514個OTU。其中，53個OTU為18份薏苡仁樣品所共有，每份樣品還包括119～212個獨有的OTU，見圖1。稀釋性曲線分析表明所有樣品幾乎平行于x軸，表明獲得的Reads數(shù)量足以代表總體真菌群落多樣性，見圖2?；贑hao 1、Shannon、Observed_species和Goods_coverage來估計群落的Alpha多樣性，其中Chao1用來估計樣品中微生物豐富度，Shannon用來估算樣品中微生物多樣性，Observed_species代表隨測序深度的增加，實際觀測到OTU的個數(shù)，Goods_coverage代表觀測深度。YY4樣品Chao1指數(shù)和Observed_species最高，具有最高的物種豐富度。YY1樣品Shannon指數(shù)最高，物種多樣性最高。所有樣品Goods_coverage值均高于0.994，表明本次測序?qū)悠分姓婢母采w率很高，可以代表樣本中微生物的真實情況，見表2。基于非加權(quán)PCoA分析的結(jié)果表明，產(chǎn)于四川和黑龍江YY1和YY10樣品與產(chǎn)于貴州的樣品之間菌群差異性較小。YY6與YY7樣品都產(chǎn)于安徽，但兩者之間真菌群落差異較大，見圖3。

3.2 薏苡仁中真菌組成分析 在薏苡仁樣品中檢測到真菌共計4門18綱44目99科149屬。在門水平，子囊菌門Ascomycota是最優(yōu)勢菌門，相對豐度為93.96%～99.58%，見圖4a。糞殼菌綱Sordariomycetes（37.47%～86.94%）在綱水平占據(jù)優(yōu)勢地位，其次是散囊菌綱Eurotiomycetes（3.17%～58.82%）和座囊菌綱Dothideomycetes（1.73%～16.46%）。在目水平，肉座菌目Hypocreales（7.05%～70.40%）相對豐度最高，其次是散囊菌目Eurotiales（2.94%～50.92%）、格孢菌目Pleosporales（1.40%～14.95%）和爪甲團囊菌目Onygenales（0.03%～39.37%）。叢赤殼科Nectriaceae（3.79%～62.48%）是科水平最優(yōu)勢菌群，其次是曲霉科Aspergillaceae（2.88%～47.88%）、蟲草菌科Cordycipitaceae（0.07%～63.21%）、格孢菌科Pleosporaceae（1.18%～13.17%）和Arachnomycetaceae（0.03%～39.36），見圖4b。在檢測到的149屬中，鐮刀菌屬Fusarium（3.05%～60.32%）具有最高的相對豐度，其次是曲霉屬Aspergillus（2.20%～45.44%）、白僵菌屬Beauveria（0.07%～63.21%）、鏈格孢屬Alternaria（0.80%～11.92%）、Arachnomyces（0.03%～39.36%）和青霉屬Penicillium（0.24%～8.03%），見圖4c。大多數(shù)薏苡仁樣品以鐮刀菌屬和曲霉屬為優(yōu)勢菌群，而YY05樣品中Arachnomyces為優(yōu)勢菌群，YY12樣品白僵菌屬為優(yōu)勢菌群。此外，在種水平共檢測到5種潛在產(chǎn)毒真菌，分別是煙曲霉A.fumigatus、土曲霉A.terreus、梨孢鐮刀菌F.poae、囊狀青霉P.capsulatum和展青霉P.paxilli。在18份薏苡仁樣品中潛在產(chǎn)毒真菌相對豐度存在差異，總相對豐度為0.61%～7.08%，見圖5。其中，煙曲霉和梨孢鐮刀菌相對豐度最大，分別為0.06%～6.20%和0.07%～2.28%。

3.3 薏苡仁中菌群互作分析 網(wǎng)絡(luò)互作分析表明，樣本絕對豐度前20的OTU間多存在正相關(guān)。OTU2（unidentified_g_Fusarium）和OTU5（unidentified_g_Fusarium）、OTU5（unidentified_g_Fusarium）和OTU6（unidentified_p_Ascomycota）、OTU6（unidentified_p_Ascomycota）和OTU15（Acremonium fusidioides）、OTU4（unidentified_f_Cordycipitaceae）和OTU21（unidentified_f_Trichocomaceae）、OTU7（Aspergillus vitricola）和OTU13（unidentified_g_Aspergillus）、OTU8（unidentified_g_Arachnomyces）和OTU16（unidentified_g_Penicillium）、OTU12（unidentified_g_Aspergillus）和OTU45（Aspergillus penicillioides）、OTU14（unidentified_g_Aspergillus）和OTU10（unidentified_g_Aspergillus）、OTU11（Aspergillus fumigatus）和OTU4（unidentified_f_Cordycipitaceae）、OTU9（unidentified_g_Fusarium）和OTU190（p_unidentified）、OTU45（Aspergillus penicillioides）和OTU4（unidentified_f_Cordycipitaceae）、OTU17（Xeromyces bisporus）和OTU8（unidentified_g_Arachnomyces）兩兩之間存在強烈的正相關(guān)。負相關(guān)僅發(fā)現(xiàn)于OTU3（unidentified_g_Fusarium）和OTU11（Aspergillus fumigatus）及OTU3（unidentified_g_Fusarium）和OTU13（unidentified_g_Aspergillus）之間，見圖6。

4 討論

中藥污染真菌的現(xiàn)象普遍存在，引起廣泛關(guān)注。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)已成為研究環(huán)境微生物多樣性的重要手段。在前期研究中，我們探索了Illumina Miseq測序技術(shù)對藥食兩用酸棗仁中污染真菌多樣性進行分析的適用性，結(jié)果表明高通量測序技術(shù)是分析酸棗仁中污染真菌的有效工具。酸棗仁樣品污染真菌中最優(yōu)勢菌群是曲霉屬，其次是假絲酵母屬Candida和節(jié)擔菌屬Wallemia。在發(fā)霉和未發(fā)霉酸棗仁樣品中真菌群落存在明顯差異性，發(fā)霉樣品中曲霉屬真菌占優(yōu)勢，未發(fā)霉樣品中假絲酵母屬真菌相對豐度更高[17]。鑒于高通量測序技術(shù)的有效性，本研究應(yīng)用該技術(shù)對藥食兩用薏苡仁中污染真菌多樣性進行了分析，共檢測到4門18綱44目99科149屬的真菌，驗證了高通量測序技術(shù)對中藥材中污染真菌多樣性研究的適用性。多項研究結(jié)果[6，18-20]表明，曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬和鏈格孢屬真菌是中藥材中常見的污染真菌，也是產(chǎn)生真菌毒素的重要菌群。種子類中藥材因富含豐富的油脂而易被真菌污染，本研究中的18份薏苡仁樣品中均檢測到豐富的真菌。其中，最優(yōu)勢屬是鐮刀菌屬，其次是曲霉屬、白僵菌屬、鏈格孢屬、Arachnomyces和青霉屬。此外，在這些屬中鑒定到了潛在的產(chǎn)毒真菌煙曲霉、土曲霉、梨孢鐮刀菌、囊狀青霉和展青霉，總相對豐度為0.61%～7.08%。這些真菌在適宜條件下可能會產(chǎn)生煙曲霉素、土曲霉素和展青霉素等真菌毒素，威脅到薏苡仁的安全使用。因此，利用高通量測序技術(shù)對中藥材中污染真菌進行快速準確鑒定可為藥材污染真菌毒素提供早期風(fēng)險預(yù)警。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：376.

[2]劉帆，侯林，張曉平，等.薏苡仁多糖抗腫瘤作用及免疫作用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，21（3）：123-126.

[3]王彥芳，季旭明，趙海軍，等.薏苡仁多糖不同組分對脾虛水濕不化大鼠模型免疫功能的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（3）：1303-1306.

[4]徐梓輝，周世文，黃林清.薏苡仁多糖的分離提取及其降血糖作用的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，22（6）：578-581.

[5]喻巧容，黃鎖義.薏苡化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2019，16（15）：21-24.

[6]郭夢月，龐曉慧.中藥材污染曲霉屬真菌鑒定研究進展[J].中草藥，2018，49（16）：3933-3941.

[7]張鑫，王福，陳鴻平，等.中藥材真菌及真菌毒素污染研究現(xiàn)狀[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（11）：2381-2388.

[8]李峻媛.薏苡仁中常見真菌毒素的檢測方法及不同儲藏條件下真菌毒素含量變化的研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[9]王曉紅，豆金彥，肖正國.不同儲藏條件下薏苡仁中真菌毒素含量變化的研究[J].西部中醫(yī)藥，2018，31（8）：20-23.

[10]Nilsson RH，Anslan S，Bahram M，et al.Mycobiome diversity：high-throughput sequencing and identification of fungi[J].Nat Rev Microbiol，2019，17（2）：95-109.

[11]White TJ，Bruns T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In：Gelfand DH.，Sninsky JJ，White TJ（ed.）.PCR Protocols a Guide to Methods and Applications.San Diego：Innis Academic，1990：315-322.

[12]Caporaso JG，Kuczynski J，Stombaugh J，et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nat Med，2010，7（5）：335-336.

[13]Edgar RC.UPARSE：highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J].Nat Methods，2013，10（10）：996-998.

[14]Edgar RC.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics，2010，26（19）：2460-2461.

[15]Nilsson RH，Larsson KH，Taylor AFS，et al.The UNITE database for molecular identification of fungi：handling dark taxa and parallel taxonomic classifications[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D259-D264.

[16]Schloss PD，Westcott SL，Ryabin T，et al.Introducing mothur：open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities[J].Appl Environ Microbiol，2009，75（23）：7537-7541.

[17]Guo M，Jiang W，Luo J，et al.Analysis of the Fungal Community in Ziziphi Spinosae Semen through High-Throughput Sequencing[J].Toxins，2018，10（12），494.

[18]Rocha-Miranda F，Venancio A.Mycotoxigenic fungi in plant-based supplements and medicines[J].Curr Opin Food Sci，2019，30：27-31.

[19]Su C，Hu Y，Gao D，et al.Occurrence of Toxigenic Fungi and Mycotoxins on Root Herbs from Chinese Markets[J].J Food Prot，2018，81（5）：754-761.

[20]Zheng RS，Wang WL，Tan J，et al.An investigation of fungal contamination on the surface of medicinal herbs in China[J].Chin Med，2017，12（1）：2.

（2020-02-10收稿 責任編輯：芮莉莉）