基于DNA條形碼技術(shù)的中藥材木通種子鑒定研究

穆威杉 于娟 趙晴

摘要 目的：利用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）及葉綠體psbA-trnH序列對中藥材木通種子進行鑒定，建立其種子DNA條形碼鑒定方法，保障中藥材木通種子的準確性。方法：收集木通種子樣品15份，通過提取DNA、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增、雙向測序，獲取其ITS2及psbA-trnH序列。基于BLAST分析、鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建進行物種鑒定分析。結(jié)果：共獲得4種類型ITS2序列，2種類型psbA-trnH序列。ITS2及psbA-trnH均可區(qū)分木通與川木通、關(guān)木通，但ITS2序列可以區(qū)分木通與三葉木通、白木通，psbA-trnH序列無法區(qū)分木通與三葉木通、白木通。結(jié)論：DNA條形碼技術(shù)可用于木通種子及其易混偽品的鑒定。

關(guān)鍵詞 木通;種子;DNA條形碼;ITS2;psbA-trnH;鑒定;混偽品;序列分析

Abstract Objective：By internal transcribed spacer 2（ITS2）and plastid intergenic region psbA-trnH sequences，the Akebiae Caulis seeds would be identified and DNA barcoding technology has been established，to guarantee the species authenticity of Akebiae Caulis seeds，a Chinese medicinal material.Methods：A total of 15 samples of Akebiae Caulis seeds were collected from different areas.Their ITS2 and psbA-trnH sequences have been obtained after DNA extraction，polymerase chain reaction（PCR）and bi-directional sequencing.Species identification analysis was based on BLAST analysis and neighbor joining（NJ）phylogenetic tree method.Results：A total of 4 types of ITS2 sequences and 2 types of psbA-trnH sequences were obtained.ITS2 and psbA-trnH sequences can distinguish Akebiae Caulis and Clematidis Armandii Caulis，and Caulis Aristolochiae Manshuriensis.But the ITS2 sequence can distinguish Akebia quinata and Akebia trifoliata，Akebia trifoliata var.austrais.The psbA-trnH sequence cannot distinguish Akebia quinata and Akebia trifoliata，Akebia trifoliate var.austrais.Conclusion：DNA barcoding can be useful for origin identification of Akebiae Caulis seeds and its adulterants.

Keywords Akebiae Caulis;Seeds;DNA barcoding;ITS2;psbA-trnH;Identification;Adulterants; Sequence analysis

木通為木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三葉木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.austrais（Diels）Rehd.的干燥藤莖，具有通經(jīng)下乳、利尿通淋、清心除煩的功效，是龍膽瀉肝丸等10余種中成藥的處方成分[1]。木通科植物的主要有效化學成分為三萜皂苷，另外還含有木脂素類、黃酮類、有機酸等成分[2-3]，具有很高的藥用價值。現(xiàn)代藥理學表明，木通可以利尿抗菌[4]、抗腫瘤[5]，具有顯著的抗氧化活性[6-7]，木通籽油提取物具有抗腫瘤細胞增殖的藥理作用[8]。

由于本草文獻存在藥材的名字與實際不符、不同地區(qū)用藥習慣不同以及同名異物的現(xiàn)象，導致市售木通基原混亂，尤其易將木通與川木通、關(guān)木通混淆[9]。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）記載，川木通來源于毛茛科鐵線蓮屬植物小木通Clematis armandii Franch.或繡球藤Clematis montana Buch.-Ham.的干燥藤莖[1]。關(guān)木通為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴Aristolochia manshuriensis Kom.的干燥藤莖[10]。根據(jù)黃得棟等[11]對木通及川木通藥材的使用和市場情況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)由于川木通進貨容易、收益較高，部分商家難以區(qū)分川木通與木通，市場上存在川木通代替木通的現(xiàn)象。關(guān)木通曾在1963版至2000版《中國藥典》中被收載，但由于其含有馬兜鈴酸類成分，可導致腎毒性[12]，關(guān)木通已于2003年被國家藥品監(jiān)督管理局禁用[13]。另外有研究證明，馬兜鈴酸Ⅰ更容易被微粒體細胞色素P450氧化，明確了其較高的致癌性[14]。木通、川木通、關(guān)木通3種“木通類”藥材雖名字相近，但化學成分及療效均存在差異，若將處方中的正品木通誤以混偽品代替，不僅藥效難以保障，還會給臨床用藥帶來嚴重的安全隱患。在國家取消關(guān)木通的藥用標準之后，木通的正品地位得到加強，市場對木通的需求量逐漸增加，木通的人工繁殖和栽培逐漸引起人們重視。木通可以通過種子、埋條、分根、扦插[15]等方式繁殖，從源頭上確保木通種子物種正確至關(guān)重要。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術(shù)[16]。這種鑒定方法不依賴于專業(yè)人員的主觀經(jīng)驗以及植物的形態(tài)特征，不受時間、氣候等外界因素的影響[17]，針對物種的遺傳信息進行鑒定，具有客觀、準確等優(yōu)點，是對中藥傳統(tǒng)鑒定法的有效補充[16]。目前，DNA條形碼鑒定技術(shù)日漸成熟，已經(jīng)逐步應(yīng)用于種子種苗的鑒定中。高婷等[18]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對種子類中藥冬葵子和苘麻子及其混偽品進行鑒定，證明ITS2序列可以準確鑒定冬葵子和苘麻子。林鳳越等[19]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對人參及同屬易混品西洋參種子進行研究，證實了ITS2序列可以用于人參種子真?zhèn)舞b定。本課題組已利用DNA條形碼技術(shù)對中藥材桔梗種子[20]、黃芩種子[21]、金蓮花種子[22]、北蒼術(shù)種苗[23]的ITS2序列及知母種子[24]的psbA-trnH序列進行鑒定研究，表明DNA條形碼技術(shù)可準確有效地鑒定這些中藥材種子種苗的真?zhèn)巍７N子種苗作為中藥材種植的源頭，其鑒定標準及生產(chǎn)經(jīng)營管理機制仍不夠完善[25-26]，將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于種子種苗的鑒定，從源頭對藥材的基原進行把關(guān)，對推進中藥材種子種苗的標準化有重要意義。

本實驗以木通種子為研究對象，嘗試建立基于ITS2序列和psbA-trnH序列的木通種子DNA條形碼鑒定新方法，為準確鑒定木通種子真?zhèn)翁峁┮罁?jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 球磨儀（Retsch公司，德國，型號：MM400型）;渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：VORTEX-5型）;三溫三控水槽（海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：DK-8D型）;離心機（Sigma公司，德國，型號：1-14型）;聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Bio-Rad公司，美國，型號：T100型）;超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號：Nanodrop One型）;電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C型）;凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國，型號：Gel DocTMXR+型）;電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，德國，型號：SQP型）。

1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號：R6718];2×Taq PCR Master Mix試劑（北京艾德萊生物科技有限公司，批號：301926AX）;GelRed核酸染料（Biotium公司，批號：41003）;AL2000 DNA Maker（北京艾德萊生物科技有限公司，批號：292253AX）;瓊脂糖（BIOWEST公司，西班牙，批號：111860）;引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.3 分析樣品 收集木通種子樣品15份，經(jīng)承德醫(yī)學院中藥研究所劉金欣副教授鑒定，均為木通屬植物種子，但無法準確鑒定到物種，所有樣品存放于承德醫(yī)學院，樣品信息見表1。木通和川木通參考序列來自《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》[17]，關(guān)木通參考序列來自于Wu等[27]的研究論文。

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA提取、PCR擴增及測序 取木通單粒種子，采用天根植物DNA提取試劑盒提取DNA。使用Nanodrop ONE型超微量分光光度計檢測木通種子DNA濃度和質(zhì)量。依據(jù)《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》[5]對木通種子DNA的ITS2和psbA-trnH片段進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行雙向測序。

2.2 數(shù)據(jù)分析 測序峰圖利用CodonCode Aligner v.8.0.2軟件進行校對拼接，切除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)域獲得ITS2序列，5.8S motif的序列為“CGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA”，28S motif的序列為“CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC”;切除psbA和trnH區(qū)域以獲得psbA-trnH序列，psbA motif的序列為“TCGAGCTCCAGCGACAAATGGATAA”，trnH motif的序列為“GGCGGATGTACCCAAGTGGCTCAGG”。在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn）對所獲得的序列進行BLAST比對，利用MEGA-X-10.0.5軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.3 結(jié)果

2.3.1 DNA提取、PCR擴增、測序測定及序列注釋DNA提取結(jié)果顯示，木通種子樣品DNA濃度平均值為112.6 ng/μL，A260 nm/A280 nm值多數(shù)位于1.8～2.0之間，表明提取的DNA質(zhì)量較高，可進行后續(xù)實驗。電泳凝膠成像檢測表明：ITS2和psbA-trnH序列分別在500 bp和600 bp左右呈現(xiàn)單一且明亮條帶。測序結(jié)果表明：ITS2序列可以獲得高質(zhì)量雙向測序峰圖，部分樣品存在較少數(shù)量的SNP套蜂;psbA-trnH序列由于存在兩處長度在10 bp以上的polyT結(jié)構(gòu)，影響polyT結(jié)構(gòu)之間部分的測序質(zhì)量，但經(jīng)雙向序列拼接和序列矯正后可以滿足后續(xù)分析需要?；谕菩蛄袠?gòu)建ITS2和psbA-trnH序列注釋用motif，注釋后ITS2和psbA-trnH序列長度分別為216 bp和476～471 bp（含不確定長度polyT）。

2.3.2 基于ITS2序列的木通種子鑒定 共獲得4種類型（I1、I2、I3、I4）的ITS2序列，比對后序列長度為216 bp。經(jīng)BLAST序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，I1、I2、I3可以鑒定為三葉木通或白木通，I4可以鑒定為木通;木通可以與三葉木通、白木通相互區(qū)分，第190位的G堿基是木通的專屬性SNP鑒定位點;白木通作為三葉木通的亞種，無法與三葉木通清晰區(qū)分，部分樣品在第42位、50位、103位、173位存在不同程度的測序套蜂;共有8個樣品存在個體間的ITS2序列差異，表明樣品內(nèi)種子存在不同程度的異質(zhì)性;由NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，4種類型的ITS2序列與木通藥材不同基原參考序列聚為獨立的一大支，可以與川木通、關(guān)木通清晰區(qū)分，見圖1，具備與混偽品的區(qū)分鑒定能力。

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（2020-02-10收稿 責任編輯：芮莉莉）