基于TaqMan實時熒光PCR檢測植物中轉基因成分

劉國強 海小 羅建興

摘 要：轉基因植物的安全性一直備受關注，轉基因成分檢測是保障食品安全、維護消費者知情權的重要手段。本研究構建并鑒定了pCry3A、pCry1A（c）、pCP4-EPSPS和pCTP2-CP4-EPSPS 4種陽性質粒，并在轉基因棉花、轉基因大豆、轉基因小麥、轉基因玉米、非轉基因玉米中分別檢測玉米內源基因（adh1）、抗蟲基因（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑基因（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS），最后將轉基因棉花和轉基因大豆DNA模板原液進行梯度稀釋確定Cry1A（c）和CP4-EPSPS的檢出限，通過檢出限檢測建立標準曲線確定此方法的轉基因成分定量檢測能力。結果表明：4種陽性質粒鑒定結果良好，可以作為轉基因檢測的陽性對照;轉基因棉花為轉入Cry1A（c）基因的抗蟲棉;轉基因大豆為轉入CP4-EPSPS基因的抗除草劑大豆;轉基因小麥為轉入Cry1A（c）基因的抗蟲小麥;轉基因玉米為轉入Cry1A（c）、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合轉基因玉米;Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針的檢出限均可達0.1ng;建立的2種標準曲線的R2≥0.95，說明引物和探針可以滿足定量檢測要求。本研究對TaqMan實時熒光PCR法檢測植物中的轉基因成分提供一些借鑒，同時為保障食品安全、維護消費者知情權提供方法支持。

關鍵詞：轉基因玉米;陽性質粒;檢出限;定量

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530002

轉基因植物是指把從微生物、植物和動物獲得的重要功能基因，利用生物化學方法將功能基因和調控基因表達的DNA序列組合成1個表達盒，之后通過各種轉基因技術將完整的表達盒轉移到植物基因組中進行表達，使植物獲得抗蟲、抗除草劑、抗病、優(yōu)質等新的農藝性狀[1]。2016年全球種植轉基因作物面積達1.851億hm2，大豆、玉米是種植面積最大的2種轉基因作物，轉基因大豆和轉基因玉米也是我國主要進口的轉基因糧食[2]。隨著轉基因技術的突飛猛進，我國已經培養(yǎng)出多種具有優(yōu)良性狀的轉基因植物，如抗蟲（轉Cry1Ab基因）[3]、抗?。ㄞDNibT基因）[4]、抗旱（轉SAMS基因）[5]、抗除草劑（轉2mG2-epsps基因）[6]等。

由于基因工程和生物技術的進步，消費市場被越來越多的轉基因農產品充斥著[7]，社會各界也越來越關注轉基因植物及其產品的安全性問題[8-11]。考慮到轉基因食品的安全、對消費者的保護以及對轉基因產品的管理，越來越多的國家對轉基因食品進行立法[12]。為了與立法相一致，許多國家的監(jiān)管機構要求提供檢測方法作為登記包含的一部分。目前，最廣泛使用同時又符合立法的檢測方法是PCR（Polymerase Chain Reaction， PCR），因為其簡單、特異、靈敏[13]。其中的實時熒光PCR通過對每個循環(huán)的擴增產物進行實時監(jiān)測，實現(xiàn)對目標DNA模板的定性和定量檢測。由于SYBR Green熒光染料PCR的缺點是包括引物二聚體在內的任何雙鏈DNA都會在嵌入染料產生熒光，會出現(xiàn)假陽性[14]。而TaqMan探針提高了實時熒光PCR的擴增效率和特異性，能夠快速并準確地得到檢測結果[15]。相比之下，TaqMan實時PCR方法是轉基因檢測的最佳方案，最關鍵的是這種方法與法律相一致[16]。綜上所述，研發(fā)出科學并合理的特異性檢測轉基因植物TaqMan實時熒光PCR方法是非常必要的。

蘇云金芽孢桿菌d-內毒素Cry3A基因[17]和Cry1A（c）基因[18]是2種比較常見的抗蟲基因，被廣泛運用于轉基因馬鈴薯和棉花中。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶CP4-EPSPS基因[19]和含有葉綠體轉運肽的6-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的構建體CP2-CP4-EPSPS基因[20-22]是2種常見的抗除草劑基因，多數運用在大豆上。因此本研究選擇這4種基因作為轉基因成分的判定。乙醇脫氫酶adh1基因[23]作為玉米的內源基因，用來判斷體系是否正常。因此，本研究參照標準SN/T 1204-2016[24]建立了1種特異性檢測轉Cry3A、Cry1A（c）、CP4-EPSPS和CP2-CP4-EPSPS基因植物的TaqMan實時熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

轉基因棉花、轉基因大豆、轉基因小麥、轉基因玉米、非轉基因玉米均由從事轉基因基礎研究的實驗室提供。將樣品進行研磨，置于1.5mL離心管中，并保存于-4℃。

1.2 試劑

TransStart Probe qPCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司）;實時熒光定量PCR引物和探針合成（北京睿博興科公司）。

1.3 儀器

Eppendorf 5418R Centrifuge高速臺式離心機（德國Eppendorf AG公司）;Nanodrop 2000c核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher公司）;7300plus實時熒光PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.4 方法

1.4.1 引物和探針

引物與探針序列如下表1。

1.4.2 DNA提取和質量控制

取1.1準備好的植物樣品，利用溴化十六烷三甲基銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[27]提取其DNA，方法如下。稱取研磨好的樣品約50mg，置于1.5mL離心管中，加入DNA裂解液800μL，旋渦混勻，65℃金屬浴30min，期間不時振蕩混勻;13000rpm離心5min，轉移上清液于潔凈離心管中，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24/1）混合液，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液于新的離心管中加入等體積的異丙醇，充分混勻，13000rpm離心5min，棄去上清液，75%乙醇洗滌1次，晾干，加入適量的滅菌ddH2O溶解，利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀測量其濃度，將母液稀釋至100ng/μL左右，保存于-20℃。

1.4.3 反應體系與反應條件

反應體系（總體積20μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各1μL，探針1μL，模板DNA1μL，補水至20μL。

反應條件：94℃30s，1個循環(huán);94℃5s，60℃34s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)退火時收集熒光信號。

1.4.4 陽性質粒的構建

通過人工合成的方法合成抗蟲基因（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑基因（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的序列，連接到載體上，轉化進感受態(tài)細胞，經過PCR檢測、酶切、測序對陽性質粒上插入的外源序列進行驗證。

1.4.5 陽性質粒的鑒定

將1.4.4提取的大腸桿菌DNA稀釋液進行實時熒光定量PCR檢測，進行陽性質粒的鑒定實驗（每組2個平行）。

1.4.6 植物的鑒定

將提取好的轉基因棉花、轉基因大豆、轉基因小麥、轉基因玉米、非轉基因玉米DNA（每組2個平行）進行玉米內源基因（adh1）、抗蟲基因（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的檢測。

1.4.7 檢出限分析

從100ng/μL的轉基因棉花和轉基因大豆DNA稀釋液加滅菌ddH2O開始稀釋，每1/10稀釋1次，共稀釋7次。分別為100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL（每組3個平行），進行檢出限檢測實驗。

1.4.8 定量分析

根據1.4.7的檢出限分析確定棉花和大豆的定量曲線，同時分析引物和探針的定量能力。

1.4.9 數據處理

利用7300 plus實時熒光PCR擴增儀自帶分析軟件對結果進行擴增曲線和循環(huán)（Cycle threshold，Ct）的分析。每次實驗結果都以平行實驗的平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒的構建與鑒定

將提取好的大腸桿菌質粒稀釋液分別利用各自相對的抗蟲（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的引物和探針進行實時熒光定量PCR實驗，陽性質粒的檢測結果如表2所示，擴增結果如圖1所示。由表2和圖1可以看出，陽性質粒能夠匹配抗性基因的引物和探針，且擴增曲線良好。擴增結果的Ct值為15.40±0.02（pCry3A），18.52±016（pCry1A（c）），13.93±0.02（pCP4-EPSPS），16.69±0.07（pCTP2-CP4-EPSPS）。綜上所述，陽性質粒的鑒定結果良好，可以作為轉基因檢測的陽性對照。

2.2 植物的鑒定

將轉基因棉花、轉基因大豆、轉基因小麥、轉基因玉米和非轉基因玉米的DNA，分別利用玉米內源（adh1）、抗蟲（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的引物和探針進行實時熒光定量PCR實驗，擴增結果如表3和圖2所示，Ct值≤35判定為檢出。由表3和圖2可知，adh1基因在轉基因玉米和非轉基因玉米中均有檢出（圖2A），Ct值分別是33.89±0.04和30.01±0.15;Cry3A基因在所選植物樣品中均沒有檢出;Cry1A（c）基因在轉基因棉花、轉基因小麥和轉基因玉米中均有檢出（圖2B），Ct值分別是25.27±0.03、33.08±0.09和33.95±0.08;CP4-EPSPS基因在轉基因大豆和轉基因玉米中均有檢出，Ct值分別是32.29±0.11和33.87±0.69（圖2C）;CTP2-CP4-EPSPS只在轉基因玉米中有檢出，Ct值為33.10±0.25（圖2C）。綜上所述，轉基因棉花為轉入Cry1A（c）基因的抗蟲棉;轉基因大豆為轉入CP4-EPSPS基因的抗除草劑大豆;轉基因小麥為轉入Cry1A（c）基因的抗蟲小麥;轉基因玉米為轉入Cry1A（c）、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合轉基因玉米。

2.3 檢出限分析

通過Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針對100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL等8個不同濃度梯度的轉基因棉花樣品DNA和轉基因大豆樣品DNA進行熒光定量PCR擴增實驗，結果如圖3所示，具體數值如表4所示。由圖3和表4可知，稀釋至0.1ng/μL的轉基因棉花樣品DNA（圖3A）和轉基因大豆樣品DNA（圖3B）也出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值分別為34.59±0.34和34.51±0.08，以擴增結果Ct值≤35時判定為確認檢出，所以上述結果表明Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針已達到檢出限度。綜上所述，Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針的檢出限均可達0.1ng。

2.4 定量分析

利用棉花DNA和大豆DNA做標準曲線定量檢測轉基因棉花中Cry1A（c）和大豆中CP4-EPSPS的含量。根據2.3的實驗結果制作棉花（Cry1A（c））和大豆（CP4-EPSPS）定量檢測標準曲線，如圖4所示。所得棉花（Cry1A（c））的標準曲線為y=-2.428x+47.007，R2=0.984;大豆（CP4-EPSPS）的標準曲線為y=-1.246x+40.669，R2=0.96556。因為R2≥0.95，所以這2種引物和探針可以達到定量要求，即可根據此標準曲線定量檢測植物中轉基因成分的含量?？赏ㄟ^將檢測植物的相應成分的Ct值帶入標準曲線中的公式可以得到植物種轉基因成分的定量檢測結果。以上所述都說明以上2種抗性基因的引物和探針具有較好的定量檢測能力。

3 討論

目前最被人們接受的轉基因成分的檢測方法是基于DNA分子的，因為DNA分子經過極端條件處理穩(wěn)定性也很高[28，29]。迄今為止已經報道單一測定反應中能夠檢測多達5個轉基因成分的多重傳統(tǒng)PCR系統(tǒng)[30-32]。這些測定中獲得的擴增片段，可以在瓊脂糖凝膠中進行鑒定。盡管該方法非常適用于定性分析，但其檢出限較差，可通過使用更靈敏的檢測技術（實時熒光PCR技術）來改善。實時熒光PCR技術中的TaqMan實時熒光定量PCR因為擁有不同熒光染料來標記多個獨立的探針，其特異性大大加強而且適用于定量檢測使其脫穎而出[33]，同時檢測過程中處于封閉體系中進行擴增，降低了電泳過程中PCR產物被污染的可能，有效地減少了檢測時間，特別是檢測大批量樣品時其優(yōu)勢尤為明顯[34]。

本研究的創(chuàng)新點在于構建陽性質粒和在檢出限的基礎上通過建立標準曲線來評價方法的定量檢測能力。通過NCBI數據庫得到4種抗性基因的序列，構建陽性質粒。通過鑒定，4種陽性質粒（pCry3A、pCry1A（c）、pCP4-EPSPS和pCTP2-CP4-EPSPS）結果良好，可以作為轉基因成分檢測的陽性對照。對轉基因棉花、轉基因大豆、轉基因小麥、轉基因玉米和非轉基因玉米進行鑒定，得到轉基因棉花為轉入Cry1A（c）基因的抗蟲棉;轉基因大豆為轉入CP4-EPSPS基因的抗除草劑大豆;轉基因小麥為轉入Cry1A（c）基因的抗蟲小麥;轉基因玉米為轉入Cry1A（c）、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合轉基因玉米。對轉基因棉花和轉基因大豆DNA模板原液進行梯度稀釋確定Cry1A（c）和CP4-EPSPS的檢出限為0.1ng。根據檢出限結果建立的2種抗性基因的定量曲線R2≥0.95，根據此標準曲線可以定量檢測植物中轉基因成分的含量。

4 結論

綜上所述，上述方法可以有效鑒定轉基因植物和對轉基因植物進行定量分析。隨著生物技術作物的快速發(fā)展，人們越來越關注生物技術作物衍生食品和飼料產品的潛在風險。為了保護消費者的知情權和實施轉基因標簽政策的先決條件時可以使用可靠且高效的檢測技術準確測量食品或飼料產品中的轉基因成分[35];國際貿易也需要可靠的轉基因生物分析，以便對產品中轉基因成分的可比較進行測量[36]。這些因素都促使轉基因檢測技術朝著高效、快速的方向發(fā)展[37]，所以多重實時熒光定量的多通道檢測[20，22，38]、環(huán)介導等溫技術的快速檢測[39]以及數字液滴PCR的高通量檢測[40，41]將會成為未來轉基因檢測的研究方向。

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（責任編輯 常陽陽）