生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿微生物菌相變化的影響

阿爾祖古麗·阿卜杜外力　玉素甫·蘇來曼　巴吐爾·阿不力克木

摘 要：研究生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿微生物菌相變化的影響。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)對鮮羊腿（0 d）、腌制3 d以及對照組、生姜蛋白酶添加量0.05%組（S組）、獼猴桃蛋白酶添加量0.05%組（M組）風(fēng)干前期（8 d）、風(fēng)干中期（15 d）、風(fēng)干后期（23 d）、成熟期（30 d）工藝點(diǎn)的干腌羊火腿微生物菌相變化進(jìn)行測定。結(jié)果表明：腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、表皮巨球菌（Macrococcus epidermidis）、土壤葡萄球菌（S. edaphicus）、哈夫尼亞菌（Hafnia paralvei）、明串珠菌（Leuconostoc gelidum）是各組干腌羊火腿的優(yōu)勢菌，其中葡萄球菌屬種類較多;2 種蛋白酶可豐富干腌羊火腿微生物的種類;生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶處理組成熟30 d時(shí)均出現(xiàn)木糖葡萄球菌（S. xylosus）;在整個(gè)加工過程中，干腌羊火腿微生物菌相變化較穩(wěn)定，受2 種蛋白酶的影響不大。

關(guān)鍵詞：干腌羊火腿;生姜蛋白酶;獼猴桃蛋白酶;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳;菌相變化

Effect of Zingibain and Actinidin on Microfloral Changes during Processing and Ripening of Dry-Cured Mutton Ham

Aerzuguli·ABUDUWAILI， Yusufu·SULAIMAN， Batuer·ABULIKEMU*

（College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Agricultural University， ?rümqi 830052， China）

Abstract： This work studied the effects of zingibain and actinidin on microfloral changes during the processing and ripening of dry-cured mutton ham. Fresh and three-day salted Biceps femoris muscles as well as samples from the control， 0.05% zingibain and 0.05% actinidin addition groups taken at the early （day 8）， middle （day 15） and later stages （day 23） of air drying and on day 30 of ripening were used as experimental objects. Polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE） was used to analyzed the microflora. Results showed that Staphylococcus saprophyticus， Macrococcus epidermidis， S. edaphicus， Hafnia paralvei， and Leuconostoc gelidum were the dominant bacteria in all samples. Staphylococcus was the most diverse genus. The two proteases could enrich the microbial species in dry-cured mutton ham. Staphylococcus xylosus appeared on day 30 of maturation for the treatment groups. During the entire process， the microflora remained relatively stable and was little affected by the two proteases.

Keywords： dry-cured mutton ham; zingibain; actinidin; polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis; microfloral change

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010

中圖分類號：TS251.53 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）04-0008-05

引文格式：

阿爾祖古麗·阿卜杜外力， 玉素甫·蘇來曼， 巴吐爾·阿不力克木. 生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿微生物菌相變化的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（4）： 8-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010. ? ?http：//www.rlyj.net.cnAerzuguli·ABUDUWAILI， Yusufu·SULAIMAN， Batuer·ABULIKEMU. Effect of zingibain and actinidin on microfloral changes during processing and ripening of dry-cured mutton ham[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 8-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010. ? ?http：//www.rlyj.net.cn變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)是1979年由Fischer[1]、Lerman[2]等提出的一種分離微生物的凝膠電泳技術(shù)[3-4]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是在傳統(tǒng)微生物技術(shù)基礎(chǔ)上擴(kuò)增rDNA或rRNA，從而用于分子鑒定，并在微生物多樣性研究方面得到良好應(yīng)用的一種技術(shù)[5-6]。PCR-DGGE技術(shù)的原理是從樣品中直接提取細(xì)菌總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)通過梯度分布的不同質(zhì)量濃度聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行解鏈，隨解鏈程度的增加，其遷移率逐漸減小，從而將DNA（長度相同但堿基序列不同）分離[7]。相對于傳統(tǒng)微生物分離鑒定方法，PCR-DGGE技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)快速、可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)[8]。

PCR-DGGE技術(shù)在肉制品中主要用于研究新疆熏馬腸[9]、風(fēng)干羊肉[10]、熱鮮肉[11]、冷鮮羊肉[12]、氣調(diào)包裝切片熟肉制品[13]、真空包裝牛肉[14]、冷卻牛肉[15]、低溫貯藏豬肉[16]、真空包裝煙熏火腿切片[17]、魚類[18]、冰鮮雞[19]、鹽水鵝[20]等的微生物菌相變化。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)研究生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿菌相變化的影響，為外源植物蛋白酶在干腌羊火腿中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆綿羊鮮后腿 烏魯木齊沙依巴克區(qū)和田街農(nóng)貿(mào)市場牛羊肉配送中心。

生姜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg）、獼猴桃蛋白酶（酶活力≥500 U/mg） 上海鼓臣生物技術(shù)有限公司;

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Go Taq Green Master Mix、Tris-堿、丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、瓊脂糖、尿素、四甲基乙二胺、Na2EDTA·2H2O 天根生化科技公司;Marker 東勝生物科技有限公司;乙醇（體積分?jǐn)?shù)75%、95%）、硝酸銀、冰乙酸、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、甲醛 康濟(jì)藥械有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;Avanti-J-26S XPI落地式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter有限公司;

SWC7-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;INGENYphorU-2 DGGE電泳儀、C1000 PCR擴(kuò)增儀?美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌羊火腿加工工藝

工藝流程：新鮮羊后腿→冷卻修整→低溫腌制→浸泡洗腿→吊掛風(fēng)干→成熟→成品

工藝條件：參考阿爾祖古麗·阿卜杜外力等[21]的方法。

1.3.2 取樣

以羊腿股二頭肌為采樣點(diǎn)，分別設(shè)置生姜蛋白酶添加量0.05%（占原料肉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）處理組（S組）、獼猴桃蛋白酶添加量0.05%處理組（M組）和對照組，分別于風(fēng)干前期（8 d）、風(fēng)干中期（15 d）、風(fēng)干后期（23 d）、成熟期（30 d）工藝點(diǎn)及鮮羊腿（0 d）、腌制（3 d）階段取樣，置于-20 ℃冷凍保藏，用于微生物菌相測定。蛋白酶均為腌制（3 d）結(jié)束后添加。

1.3.3 細(xì)菌總DNA提取

參考Golowczyc等[22]的方法，并稍作修改。在無菌條件下稱取15 g肉樣，剪碎，將肉樣放入200 mL錐形瓶中，加入150 mL生理鹽水，在搖床上37 ℃條件下振搖40 min，結(jié)束后靜置10 min，取上層液體轉(zhuǎn)移到滅菌的50 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的滅菌離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取沉淀于2 mL滅菌的離心管中;根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)菌總DNA，提取結(jié)束后將其溶于50～100 μL試劑盒所帶TE緩沖液（由Tris和乙二胺四乙酸配制而成）中，用瓊脂糖電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，如450～500 bp處有條帶說明DNA提取成功，將細(xì)菌總DNA在-20 ℃條件下保存，用于PCR擴(kuò)增。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

對提取的細(xì)菌總DNA 16S rDNA的V6～V8區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用引物序列[23-24]：上游引物帶GC夾子的U968為5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3、下游引物L(fēng)1401為5-CGGTGTGTACAAGACCC-3，以上引物均由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL、引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序[25]：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，如有明亮條帶出現(xiàn)，說明DNA提取并擴(kuò)增成功，將PCR產(chǎn)物在-20 ℃條件下冷凍保存，用于DGGE分析。

1.3.5 DGGE分析

對細(xì)菌16S rDNA的V6～V8區(qū)片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析：按照韓鮮娜[26]的方法進(jìn)行制膠;用蠕動泵將高質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度膠灌進(jìn)DGGE制膠玻璃板，凝固后再用醫(yī)用無菌注射器灌濃縮膠，完全凝固后將制膠裝置放入裝有3/5電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)，先在200 V電壓下預(yù)電泳10 min，隨后在90 V電壓下電泳16 h[27]。

電泳結(jié)束后，按照韓鮮娜[26]的方法，取出膠片置于干凈的不銹鋼容器中，倒入250 mL 1×固定液，振搖3 min;倒掉固定液，再加入250 mL銀染溶液，振搖15 min;倒掉銀染溶液，用去離子水對凝膠和容器進(jìn)行清洗后，倒入250 mL去離子水，振搖2 min;倒掉去離子水，加入顯色液，振搖至出現(xiàn)清晰條帶為止;棄去顯色液，加入250 mL 1×固定液，振搖5 min;棄去固定液，進(jìn)行照相和割膠。

1.3.6 DNA回收、純化、測序

DNA回收：將染色后的DGGE膠片置于白光板上，用無菌手術(shù)刀切下DGGE膠上不同位置的條帶，分別放入1.5 mL滅菌離心管中，再加入20 μL蒸餾水，置于4 ℃條件下過夜。

DNA測序：以回收的DNA為模板，取2 μL進(jìn)行16S rDNA V6～V8區(qū)域的擴(kuò)增，上游引物U968為5-AACGCGAAGAACCTTAC-3，下游引物L(fēng)1401為5-CGGTGTGTACAAGACCC-3，PCR擴(kuò)增方法同1.3.4節(jié)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，在450～500 bp處有明亮條帶出現(xiàn)可以證明該回收DNA的存在，然后將剩余PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

測序后獲得16S rDNA基因片段序列，通過NCBI中的BLAST將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 干腌羊火腿細(xì)菌總DNA提取結(jié)果

S. 0.05%生姜蛋白酶處理組;M. 0.05%獼猴桃蛋白酶處理組。下同。

采用DNA提取試劑盒在無菌條件下從不同干腌羊火腿中提取細(xì)菌總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1可知，各組樣品均得到明亮條帶，說明提取方法得當(dāng)，提取效果良好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)菌16S rDNA V6～V8可變區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

以干腌羊火腿細(xì)菌總DNA為模板，用引物對

16S rDNA V6～V8可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約450～500 bp的特異性片段。由

圖2可知，各組樣品均有明亮的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，說明本研究的PCR擴(kuò)增條件合適，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行后續(xù)DGGE分析。

2.3 干腌羊火腿中微生物DGGE圖譜主要條帶序列分析

由圖3可知，同一泳道、不同位置的條帶代表不同的微生物。選擇DGGE圖譜中的條帶進(jìn)行割膠、測序，登錄NCBI用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫與已知序列進(jìn)行相似性分析，所測序列大小均為415 bp左右，分析結(jié)果如表1所示。結(jié)合圖3和表1分析可知，表皮巨球菌（條帶4）、腐生葡萄球菌（條帶8）、土壤葡萄球菌（條帶9）、哈夫尼亞菌（條帶12）、明串珠菌（條帶14）等為各組干腌羊火腿加工過程中的主要優(yōu)勢菌，并均存在于各組干腌羊火腿加工的各階段。腐生葡萄球菌（條帶1和2）、表皮巨球菌（條帶3）、條帶5、琥珀葡萄球菌（條帶6）也存在于干腌羊火腿加工過程中的各個(gè)階段，但條帶較暗。腐生葡萄球菌（條帶7）主要存在于獼猴桃蛋白酶處理組，木糖葡萄球菌（條帶11）主要存在于生姜蛋白酶處理組成熟期（S組30 d）和獼猴桃蛋白酶處理組成熟期（M組30 d）。明串珠菌（條帶13）存在于各取樣階段，但獼猴桃蛋白酶處理組成熟期條帶顏色最深。明串珠菌（條帶10和15）均存在于加工過程，但條帶較細(xì)。條帶16存在于各加工階段，對照組23 d和M組30 d條帶最為明顯，但測序失敗。Allobranchiibius huperziae（條帶17）存在于各加工階段。

3 討 論

目前利用PCR-DGGE法檢測肉制品中微生物的研究較多，且主要集中在發(fā)酵香腸的微生物區(qū)系、香腸成熟過程中微生物種群的動態(tài)變化研究等方面。采用PCR-DGGE法對各階段干腌羊火腿中微生物菌相變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，整體來說，各組干腌羊火腿細(xì)菌多樣性較為豐富。

微生物在干腌火腿風(fēng)干成熟過程中的作用不可忽視。大量研究表明，乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌等是火腿和發(fā)酵香腸等傳統(tǒng)腌制肉制品中的常見微生物。干腌羊火腿的微生物主要來自于腌制以及風(fēng)干過程中表面微生物的入侵。本研究結(jié)果表明，葡萄球菌、明串珠菌、表皮巨球菌、哈夫尼亞菌是干腌羊火腿的優(yōu)勢菌，其中葡萄球菌的種類較其他菌種多。張波等[10]對風(fēng)干羊肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究得出，葡萄球菌為優(yōu)勢菌種;黃艾祥[28]對云南牛肉干巴和云南干腌火腿進(jìn)行研究得出同樣的結(jié)果。肉制品中生長的乳酸菌和葡萄球菌可以分解肉中的蛋白質(zhì)，并有助于產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì)，從而提高產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值[29-30]。本研究中，各組干腌羊火腿加工前期和后期的微生物組成較穩(wěn)定，原因可能是腌制期溫度較低，對火腿內(nèi)部微生物有抑制作用，在后續(xù)風(fēng)干過程中溫度逐步上升，火腿的鹽含量也上升，對微生物的生長有抑制作用。

4 結(jié) 論

通過PCR-DGGE技術(shù)對添加生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶的干腌羊火腿微生物菌相變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明：腐生葡萄球菌、表皮巨球菌、土壤葡萄球菌、哈夫尼亞菌、明串珠菌是各組干腌羊火腿的優(yōu)勢菌，其中葡萄球菌屬種類較多;2 種蛋白酶可豐富干腌羊火腿中微生物的種類，2 種蛋白酶處理組成熟期30 d時(shí)均出現(xiàn)木糖葡萄球菌;在整個(gè)加工過程中，干腌羊火腿微生物菌相變化較穩(wěn)定，受2 種蛋白酶的影響不大。

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收稿日期：2020-01-13

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260381）

第一作者簡介：阿爾祖古麗·阿卜杜外力（1992—）（ORCID： 0000-0001-7367-5699），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail： 17699336132@163.com

通信作者簡介：巴吐爾·阿不力克木（1968—）（ORCID： 0000-0002-6873-9632），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail： batur6805@126.com