黎嘉茗,黃國凱,李 華
(廣東省藥品檢驗所,廣東 廣州 510663)
沉香是一種名貴中藥,味辛、苦,性溫,具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效。其商品主要為國產(chǎn)沉香(瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材[1])和進口沉香(瑞香科植物沉香AquilarlaagallochaRoxb.含有樹脂的木材[2])。除藥用外,沉香還常作為天然香料、工藝品原材料等用途,市場需求量較大。由于沉香結香條件苛刻,產(chǎn)量較低,野生資源已經(jīng)基本枯竭,不能滿足藥用需求,目前藥用沉香以人工結香為主。此外,流通領域中還充斥著以其他木材充偽或非法添加松香的沉香,嚴重影響了用藥的安全和質量。
沉香主要化學成分包括倍半萜類化合物、色酮類化合物、芳香族類化合物、脂肪酸類化合物等。其中倍半萜類化合物[3]和2-(2-苯乙基)色酮[4]是其主要的藥理活性成分。沉香藥材現(xiàn)行法定質量標準[1]以浸出物含量作為其質量評價的重要指標,據(jù)研究表明,沉香的浸出物含量與其特征性成分-白木香酸的含量呈正相關[5],白木香酸的有無及含量的高低,能夠反映沉香樣品的品種真?zhèn)渭百|量優(yōu)劣。本文建立了沉香中白木香酸的UPLC-Q-TOF定量檢測方法,對全國藥品流通領域中的69批沉香樣品進行測定,為完善沉香的質量標準提供了基礎數(shù)據(jù)。
Agilent 6540 超高分辨率精確質量四級桿-飛行時間質譜儀(Agilent 1290超高效液相色譜系統(tǒng),美國);Milli-Q超純水機;KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司);XS205電子天平(Mettler Toledo)。
沉香藥材69批,從全國XX省份的零售藥店,飲片生產(chǎn)企業(yè)和中藥制劑生產(chǎn)企業(yè)中收集,樣品信息見表1。白木香酸對照品由廣東藥科大學高曉霞副教授提供,經(jīng)HPLC面積歸一化法計算,質量分數(shù)為87.83%;乙腈(色譜純,美國Honeywell公司),LCMS級甲酸(Fluka公司),甲醇(分析純,廣州化學試劑廠),水為超純水,其他試劑均為分析純。
表1 沉香樣品信息
續(xù)表1
編號收集地品種鑒定浸出物含量(%)白木香酸含量(%)41浙江合格品10.60.0642浙江合格品10.80.0143安徽合格品11.60.3044青海非法添加21.10.0045安徽劣質品7.50.0146天津合格品15.60.0547天津合格品12.40.0848湖北劣質品10.10.0949安徽合格品12.50.1150天津合格品15.20.0551安徽合格品25.20.0552安徽合格品26.10.0853河南非法添加20.40.1554安徽合格品10.90.0955安徽劣質品9.70.0056安徽合格品26.20.0257四川劣質品10.30.0858安徽合格品10.70.0159江蘇合格品12.60.0360安徽非法添加19.80.0061貴州劣質品6.70.0462湖北合格品12.70.0663四川合格品13.20.0764山東劣質品11.20.0865廣東合格品10.70.0366廣東劣質品9.20.0467安徽非法添加23.70.0068安徽劣質品8.70.0069吉林合格品16.80.11
色譜柱:Agilient Zorbax C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm);流動相:乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A),梯度洗脫條件,0~6 min,40%B;6~6.5 min,40%~90%B;6.5~10 min,90%B。流速:0.35 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進樣量:2 μL。
電噴霧離子源(ESI),正模離子掃描模式,干燥氣流速為8.0L/min;干燥氣穩(wěn)定為350 ℃;霧化氣壓力為35psi;毛細管電壓正離子模式4 000 V;錐孔電壓:75V;碎裂電壓:130V。Targeted掃描模式,Targeted分子離子為235.169 2 m/z。一級掃描范圍100~1000 m/z,二級掃描范圍50~300 m/z,碰撞能量:20 V;準確質量測定采用TFANH4、Purine、HP-0921、N/A的混合參比溶液,ESI+:m/z 121.050 873、922.009 798。
精密稱取白木香酸對照品適量,加甲醇制成濃度為0.188 μg·mL-1的對照品溶液。
取沉香粉末(過40目篩)約0.2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加乙酸乙酯10 mL,密塞,搖勻,稱定重量,超聲處理(功率200W,頻率40kHz)90 min,放冷,再稱定重量,用乙酸乙酯補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液。置于分液漏斗中,取5%碳酸鈉溶液振搖提取3次,每次10 mL,合并碳酸鈉溶液。加入適量2 mol/L鹽酸調節(jié)pH=9.0,置于分液漏斗中,取乙酸乙酯振搖萃取2次,每次20 mL,合并碳酸鈉溶液。加入適量2 mol·L-1鹽酸調節(jié)pH=1.0,取乙酸乙酯振搖萃取3次,每次15 mL,合并乙酸乙酯液。置于80 ℃水浴上蒸干,殘渣加甲醇使溶解并轉移至1 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
碎裂電壓為130 V,碰撞能量20 V。在優(yōu)化條件下,對白木香酸對照品溶液進行分析。[M-H2O+H]+峰235.1692 m/z有最大響應,一級質譜如圖1。二級質譜如圖2所示,最大的兩個碎片離子為149 m/z、217 m/z。以235.269 2 m/z為檢測離子,149 m/z和217 m/z為輔助定性離子,對樣品進行測定。正品(編號X)及偽品(編號X)一級EIC見圖3、圖4,正品可以檢測出白木香酸,而偽品無法檢測出白木香酸。
圖1 白木香酸一級質譜
圖2 白木香酸二級質譜
圖3 沉香合格樣品一級EIC
圖4 沉香偽品一級EIC
2.6.1 精密度試驗 精密吸取白木香酸對照品溶液,按照“2.2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,白木香酸的平均峰面積為50 708.04,RSD為0.7%,表明儀器精密度良好。
2.6.2 重復性實驗 取沉香樣品(編號:2015A18501),分別按照“2.2.4”項下方法制備供試品溶液6份,按照“2.2.2”項下色譜條件進樣測定,白木香酸峰面積平均值為275 233.4,RSD為2.7%,表明方法重復性良好。
2.6.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一批沉香樣品(編號:2015A18501)供試品溶液,按照“2.2.2”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進樣,白木香酸峰面積平均值為277241,RSD為1.1%,表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。
分別取69批沉香樣品,按照“2.4”項下方法制備供試品溶液,依次進樣測定,記錄譜圖,檢測結果見表1。
69批沉香樣品,按現(xiàn)行質量標準檢驗,44批為合格品,其白木香酸平均含量為0.21%。3批為偽品,均未檢出白木香酸。22批為劣質沉香,有7批未檢出白木香酸峰,經(jīng)橫切面顯微觀察,確認樣品為不含(或含極少)樹脂的白木香木材;其余15批劣質沉香的白木香酸平均含量為0.09%。
通過對比檢驗結果可知,白木香酸可作為沉香的專屬性成分,其在一定程度上還能反映樣品中樹脂含量的多少,可作為評判沉香藥材質量優(yōu)劣的依據(jù)。