附子不同炮制品對(duì)陽虛小鼠免疫功能的影響

沈玉巧，林 華*，鄧廣海，陳丹丹，劉瑤玉，周 威

(1.廣東省中醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510380)

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.子根的加工品，具有回陽救逆、散寒止痛之功效[1]。附子中的主要化學(xué)成分為生物堿，此外還含有多糖、黃酮類、皂苷類、植物甾醇等。其中附子多糖不僅能增強(qiáng)細(xì)胞免疫還能增強(qiáng)體液免疫，在抗腫瘤、抗氧化等方面均有較好的作用[2]。附子的傳統(tǒng)炮制工藝往往以減毒為主，因此常有炮制品的毒性雖然很小，但有效成分含量偏低的現(xiàn)象[2]，發(fā)揮不了功效。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了高溫、高壓、微波三種新型炮制工藝，結(jié)合傳統(tǒng)炮制工藝，對(duì)炮制品煎煮液的6種主要單雙酯型生物堿含量進(jìn)行了測定[1]，同時(shí)對(duì)4種炮制品對(duì)于陽虛小鼠免疫器官的影響進(jìn)行比較，為附子新型炮制工藝的推廣與應(yīng)用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為SPF級(jí) KM種小鼠，雌、雄各半，體質(zhì)量約20 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(小鼠合格證號(hào)：44007200012065)。

1.2 儀器與試藥

AUY220型分析天平(日本島津)、Agilent-1200型HPLC、RV 10basic V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA)。附子藥材(批號(hào)：20130812，產(chǎn)地：四川江油)由康美藥業(yè)四川江油分公司提供，經(jīng)廣東省中醫(yī)院藥劑科主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根；微波炮制品、黑順片、高溫炮制品、高壓炮制品均由實(shí)驗(yàn)室按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)條件通過同一批原藥材制得。乙腈、四氫呋喃為色譜級(jí)純；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(批號(hào)：201308011，煙臺(tái)北方制藥有限公司)；水合氯醛為分析純。

2 方法

2.1 炮制工藝

2.1.1 黑順片[1]按照藥典要求進(jìn)行炮制。

2.1.2 高壓炮制片[4]取附子生品2 kg，洗凈后噴灑膽巴水適量，蓋上用膽巴水沾濕的濕布悶潤30 min，設(shè)置壓力為0.1 MPa蒸制150 min，切薄片于50 ℃烘干去除碎屑即得。

2.1.3 高溫烘制片[5]取附子生品2 kg，每天按時(shí)更換膽巴水，泡至內(nèi)無白心，切薄片于烘箱120 ℃烘制12 h，去除碎屑即得。

2.1.4 微波炮制片[6]取附子生品2 kg，噴灑膽巴水適量，蓋上用膽巴水沾濕的濕布至透心，切薄片放入格蘭仕微波爐中，中火炮制25 min即得。

2.2 煎煮液的制備及含量測定

取附子各炮制品1 000 g加入陶瓷煎鍋中，先加10倍量水浸泡30 min后，武火至沸，再文火煎煮1 h，過濾，藥渣加8倍量的水煮沸后再煎煮30 min，合并2次煎煮液。真空減壓加熱濃縮至0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg；置于冰箱冷藏室保存。取煎煮液各10 mL，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置橢圓形旋轉(zhuǎn)燒瓶中，40 ℃減壓回收溶劑至干，向瓶中加入鹽酸-甲醇(0.05%)溶液2 mL溶解，過0.45 μm微孔濾膜即得。通過HPLC測得生品及炮制品以及炮制品煎煮液的生物堿含量。

2.3 對(duì)陽虛小鼠免疫器官的影響

取合格的SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、空白組、4種炮制品組(包括0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg三種濃度)，共14組，每組8只。參照文獻(xiàn)方法[7]，模型組及各給藥組小鼠每日灌胃給予氫化可的松琥珀酸鈉溶液1 mg/只/天，空白組小鼠每日給予同體積生理鹽水，連續(xù)造模9天。第10天開始，空白組和模型組灌胃給予蒸餾水0.2 mL/10 g，給藥組按照附子不同炮制品給藥劑量0.2 mL/10g進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥6天。于第11、13、15天灌胃給藥后，給藥組及模型組繼續(xù)給予造模給藥。于第1、5、9、10、12、15天對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重。末次給藥后24 h，斷頭處死。立即取各組小鼠的脾臟、胸腺，0.9%的生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干后稱重，計(jì)算脾臟、胸腺的質(zhì)量指數(shù)。

2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 附子生品及不同炮制品生物堿含量

測得附子生品和4種炮制品以及4種炮制品煎煮液的主要生物堿含量見表1、表2。由表1及表2可知，附子高壓炮制品及其煎煮液的單酯型生物堿含量最高，雙酯型生物堿含量最低；炮制品生物堿含量均在2015版藥典的限量范圍內(nèi)。

表1 附子生品及不同炮制品生物堿含量 (mg/g)

注：“-”代表未檢出，計(jì)算時(shí)按“0.000 0”計(jì)。

表2 附子不同炮制品煎煮液的生物堿含量 (mg/g)

注：“-”代表未檢出，計(jì)算時(shí)按“0.000 0”計(jì)。

3.2 各組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間變化趨勢

通過SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，造模9天后模型組及各給藥組小鼠體質(zhì)量與空白組小鼠體質(zhì)量比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明本次實(shí)驗(yàn)造模是成功的。由圖1、圖2、圖3四種炮制品的高、中、低三種給藥濃度的體質(zhì)量增長趨勢圖可知，4種給藥組小鼠體質(zhì)量增加幅度均較模型組變大，但無明顯差異(P>0.05)；同時(shí)高壓片組的體質(zhì)量增長幅度略高于其他3組。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(0.75 g/kg劑量組)

圖2 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(1.50 g/kg劑量組)

圖3 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(4.50 g/kg劑量組)

3.3 附子不同炮制品對(duì)陽虛小鼠免疫器官的影響

組別劑量(g/kg)胸腺指數(shù)(mg/g)脾臟指數(shù)(mg/g)空白-3.7189±1.3568?2.2194±0.2807?模型-1.5649±0.16341.2653±0.1351高溫片組高壓片組微波片組黑順片組高溫片組高壓片組微波片組黑順片組高溫片組高壓片組微波片組黑順片組0.751.504.501.9269±0.40661.9238±0.35111.7130±0.18992.1016±0.48972.3211±0.4929?2.2242±0.2788?1.9044±0.13612.3065±0.5675?2.6364±0.6458?2.8701±0.9905?2.3092±0.5118?2.7738±1.0111?1.3424±0.07221.3613±0.19581.3111±0.10511.3940±0.18761.4509±0.0503?1.5083±0.1611?1.4967±0.1626?1.4567±0.1848?1.6448±0.1719?1.7345±0.1511?1.6188±0.1518?1.6679±0.2329?

由表3可知，模型組與空白組相比，小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)出現(xiàn)較大幅度的下降(P<0.05)；與模型組相比，隨著給藥濃度的增加，附子4種炮制品組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)較模型組均有所增加。同時(shí)在給藥濃度為4.50 g/kg時(shí)，各炮制品組與模型組相比存在顯著性差異(P<0.05)，說明附子炮制品均能提高陽虛小鼠的免疫器官質(zhì)量指數(shù)；且隨著給藥濃度的增加，對(duì)免疫功能的提高作用成正相關(guān)，臟器指數(shù)的增加能夠反映免疫功能的提高[8]。附子4種炮制品組在相同給藥濃度的條件下，對(duì)陽虛小鼠免疫器官質(zhì)量指數(shù)的提高無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

4 討論

附子傳統(tǒng)的炮制工藝為了降低毒副作用，首先要通過長時(shí)間的膽巴水浸泡、再通過蒸煮等方法進(jìn)行炮制加工，毒副作用降低的同時(shí)生物堿類成分損失嚴(yán)重，而且炮制過程復(fù)雜耗時(shí)。本文通過對(duì)高溫烘制、高壓蒸制、微波炮制與傳統(tǒng)炮制的附子進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)高壓蒸制片的生物堿能夠得到較好的保存，同時(shí)對(duì)陽虛小鼠的體質(zhì)量及免疫功能的提高也較好。至于高壓蒸制工藝能否取代傳統(tǒng)炮制工藝還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持與完善。