緩釋萬古霉素的殼聚糖與氧化石墨烯溫敏水凝膠的制備及性能測定

洪瑩瑩, 王雅倩, 周小莉, 詹玉林*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科系國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心/農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2.上海健康醫(yī)學(xué)院 附屬第六人民醫(yī)院東院 骨科,上海 201306)

慢性骨髓炎多由金黃色葡萄球菌感染造成,會(huì)導(dǎo)致骨破壞和骨痂形成.外傷后人工骨的移植也會(huì)導(dǎo)致該病發(fā)生發(fā)病率高達(dá)1.5%至2.5%[1],這是骨科臨床面臨的難題之一.現(xiàn)有的材料如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠鏈等需要手術(shù)取出[2],病人不僅會(huì)承受再次手術(shù)的痛苦還增加了二次感染的概率.可降解水凝膠材料具有良好的生物相容性,在藥物控釋方面具有廣闊的應(yīng)用前景,是近幾十年來廣泛研究的一種可植入藥物傳遞基質(zhì).材料在室溫下是一種可注射流體，它可以在體溫條件下形成不易流動(dòng)，并具有一定支撐能力的膠體.因此它可以在注射后，在組織的局部原位形成水凝膠達(dá)到移植的目的，相比于創(chuàng)口較大的手術(shù)移植方式更為簡單安全[3-4].殼聚糖(chitosan,CS)作為一種天然多糖,具有抗菌、抗炎、易降解等優(yōu)勢,可以制備緩釋微球[5-6]，還可以制備可載藥的智能溫度響應(yīng)水凝膠[7].石墨烯是一種二維的碳同素異形體,具有多種優(yōu)勢,如促進(jìn)成骨活性、具有較大的藥物傳遞表面積和抗菌活性[8].氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯經(jīng)強(qiáng)酸氧化所制得的單層碳納米材料,具有良好的導(dǎo)電性能、導(dǎo)熱性能和機(jī)械性能[9],在體內(nèi)可經(jīng)水降解途徑代謝[10].尤其是它優(yōu)良的導(dǎo)電性，氧化石墨烯可以避免手術(shù)后瘢痕的形成[11].可用于腫瘤治療,骨組織工程和負(fù)載藥物等方面[4,12].CS與GO二者結(jié)合所形成的水凝膠材料CS/GO可以注入慢性骨髓炎患處,這類可降解性的材料可以避免二次手術(shù)取出[13].同時(shí)凝膠材料可以負(fù)載緩釋粒子,攜帶針對性緩釋抗生素,避免全身大劑量應(yīng)用抗生素如萬古霉素(vancomycin,VAN)所造成的耳毒性和腎毒性[14].含有可降解高聚物的緩釋微球可以延長緩釋時(shí)間[15],石墨烯的高模量可以增加凝膠穩(wěn)定性[16]和抗壓性能[17].本實(shí)驗(yàn)旨在研究一種可以包載藥物且抗壓強(qiáng)度相對較高的可注射凝膠材料,一定程度的延長載藥微球的緩釋時(shí)間，并通過一些體外測試探討其作為潛在的骨組織工程材料的可能性.

1 材料與方法

1.1 材料

CS(脫乙酰度90%),購于上海生工生物.GO(單層),購于上海源葉生物.VAN(純度>99%),購于上海邁瑞化學(xué).聚乳酸羥基乙酸共聚物(polyclactic-co-glycolic acid, PLGA,相對分子量10 000)購于上海源葉生物.聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA，低粘度，相對分子量16 000),購于上海多烯生物.

1.2 含VAN的CS/PLGA微球的制備

微球用乳化超聲法制作[15,18],進(jìn)行一定的調(diào)整改進(jìn),稱取100 mg的鹽酸萬古霉素溶于1 mL去離子水中,作為水相.稱取200 mg PLGA溶于1 mL二氯甲烷中,作為油相.將水相與油相混合后,超聲4 min形成初乳,將初乳滴加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的PVA溶液中,混勻.將復(fù)乳迅速滴加到100 mL體積比為2∶3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%PVA水溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CS乙酸溶液的混合溶液中,1 500 r/min下磁力攪拌4 h，可見微球沉淀.將含有微球的混合液置于離心機(jī)中10 000 r/min離心10 min,去離子水洗滌3次.得到載藥微球,凍干備用.

1.3 微球載藥量和包封率測定

稱取10 mg的VAN-CS/PLGA載藥微球,加入1 mL乙酸,溶解微球中的CS,離心后上清液吸出備用,沉淀用1 mL乙腈溶解,離心后上清液吸出與乙酸上清混勻作為樣品.標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙酸和乙腈體積比為1∶1混合溶液中,配制濃度梯度紫外測定后描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù) 2010 年版 《中華人民共和國國家藥典》 規(guī)定,載藥量和包封率的計(jì)算公式為:

載藥量=微粒中所含的藥質(zhì)量/微粒的總質(zhì)量×100%

包封率=微粒中包封的藥質(zhì)量/微粒中包封與未包封的總藥質(zhì)量×100%

1.4 含載藥微球的CS/GO溫敏水凝膠的制作

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CS鹽酸溶液5 mL,400 r/min磁力攪拌下逐滴加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% GO的500 μL β-甘油磷酸鈉(β-GP),用飽和的磷酸氫二鈉水溶液調(diào)至生理pH值.加入20 mg凍干后的載藥微球, 混合液超聲30 s混勻后,置于37 ℃水浴鍋中形成凝膠.

1.5 載藥微球和復(fù)合支架形貌觀察

將VAN-CS/PLGA載藥微球分散到導(dǎo)電膠上,噴金后采用掃描電鏡(Hitachi JSM-7500F,Japan)觀察微球的表面形貌.

微球的粒徑采用激光粒度儀(英國Zetasizer Nano ZS)測定Malvern.

復(fù)合支架:放入-80 ℃ 的冰箱冷凍過夜,凍干后用手術(shù)刀片將其切割為0.5 cm×0.5 cm的薄片,噴金后利用掃描電鏡觀察支架截面形貌.

1.6 支架孔隙率測定

采用無水乙醇置換法測定其孔隙率[19].將材料凍干后切成小塊,浸入裝有無水乙醇的量筒中,其中無水乙醇的體積為V1.抽真空5 min,將材料孔隙內(nèi)空氣抽空,使乙醇進(jìn)入材料孔隙內(nèi),至無氣泡溢出為止,此時(shí)總體積計(jì)為V2.將材料取出后剩余無水乙醇的體積為V3,3個(gè)平行樣品a，b，c,測定其平均值計(jì)算孔隙率結(jié)果.

材料孔隙率ε=(V1-V3)/(V2-V3)×100%.

1.7 凝膠成膠時(shí)間及支架機(jī)械強(qiáng)度測定

成膠時(shí)間:采用試管倒置法觀察其成膠,當(dāng)材料表現(xiàn)出由“自由流動(dòng)的溶膠”轉(zhuǎn)變?yōu)椤澳z狀態(tài)”.將凝膠液注入10 mL試管,置于37 ℃水浴鍋中,觀察其成膠情況,當(dāng)試管倒置30 s凝膠液仍不出現(xiàn)倒流,則視為凝膠形成[20].

機(jī)械強(qiáng)度:凝膠放入模具中,置于37 ℃下形成直徑為9 mm,高為0.5 cm的凝膠圓柱體,將圓柱體置于天平上,上方懸一可施力物體,天平另一端用塑料小杯配平后凝膠端開始施力,小杯端加水,始終保持天平為平衡狀態(tài),直至凝膠完全破碎.m為加入水的質(zhì)量，g=9.8 N/kg，S為凝膠的表面積.測量3次記錄平均值.

支架的機(jī)械強(qiáng)度計(jì)算公式為:Rc=mg/S

1.8 凝膠的可逆性[21]

將2 mL溶膠態(tài)的材料打入10 mL試管中,置于37 ℃直至形成凝膠,再將溫度降至4 ℃.觀察該凝膠是否會(huì)再變回流動(dòng)的溶膠態(tài),若有變化,則該凝膠是可逆的,反之則為不可逆的.

1.9 支架降解測定及體外釋放實(shí)驗(yàn)

降解:取20支50 mL試管,加入已成型的載藥凝膠,加入20 mL PBS緩沖液(含0.2 mg/mL溶菌酶),置于臺(tái)式恒溫?fù)u床中37 ℃,120 r/min下持續(xù)震蕩,于放入前及第7、14、21、28、35、42、48天取出仍存在的凝膠,用濾紙吸干表面水分稱質(zhì)量,繪制降解曲線.

釋放:另取20支50 mL試管,加入該凝膠,上述條件下,于第24 h及第7、14、21、28、35、42、48天取1 mL PBS,離心后利用紫外分光光度計(jì)測定其上清液藥物質(zhì)量濃度.考慮到試管內(nèi)容物濃度的穩(wěn)定性,所吸出液體的沉淀物與上清液在測試完畢后混勻滅菌,打回試管內(nèi).記錄藥物釋放速率,繪制曲線.

2 結(jié)果

2.1 微球載藥量和包封率

VAN的原始投入量為100 mg.微球中所含藥物的平均質(zhì)量為12.204 mg,PLGA/CS-VAN載藥微球的載藥率為(1.20±0.007)%,包封率為(12.20±0.668)%,VAN的最低抑菌質(zhì)量濃度為2 mg/L,所制備的微球具有適宜的載藥性能.VAN的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,4個(gè)樣品的質(zhì)量與吸光度見表1.

圖1 微球中VAN質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.1 Standard curve of vancomycin for detect the drug load of microspheres

得出該標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為：y=0.026+0.003 2x，R2=0.997 5

表1 各樣品的吸光度及由此計(jì)算出的藥物質(zhì)量

Table 1 The absorbance of each sample and the drug content

微球樣品名稱D(280 nm)m/g樣品①0.4280.099 6樣品②0.4000.106 3樣品③0.3850.100 8樣品④0.4280.102 2

2.2 載藥微球和復(fù)合支架形貌觀察

VAN-PLGA/CS載藥微球形態(tài)呈規(guī)則的球形,表面光滑(圖2a).微球粒徑分布均勻,在 5～18 μm之間,平均粒徑約為7.07 μm(圖3).由三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)VAN-CS/PLGA-CS/GO的復(fù)合支架斷面粗糙多孔、孔徑主要分布在10 μm上下、孔多類似圓形、大部分孔間相互連通、孔隙率較高(圖2b).將支架截面的掃描電鏡圖放大后,可觀察到一些顆粒狀粗糙凸起(圖2c),這些顆粒包裹在支架之中,有可能為微球或單層氧化石墨烯的顆粒狀存在,在復(fù)合支架掃描電鏡的視野范圍內(nèi)沒有觀察到獨(dú)立的“載藥微球”結(jié)構(gòu),推測是微球被支架包裹或是支架的孔隙形成“牢籠”結(jié)構(gòu)鎖住微球.

a:VAN-CS/PLGA微球;b,c: VAN-CS/PLGA-CS/GO支架a: VAN-CS/PLGA microspheres; b,c: VAN-CS/PLGA-CS/GO scaffolds

2.3 支架孔隙率、凝膠成膠時(shí)間、支架機(jī)械強(qiáng)度及可逆性

孔隙率:將支架切割為3 mm×4 mm×5 mm的小條塊,投入1.2 mL量筒內(nèi),注入1 mL無水乙醇.公式計(jì)算得其孔隙率為(66.94±1.24)%.機(jī)械強(qiáng)度及成膠效果：空白CS凝膠<加入載藥微球組<加入GO與載藥微球組(表2).推測產(chǎn)生這樣結(jié)果的原因是:加入載藥微球組的凝膠粘度增加,微球表面可以分散一部分所受外力.而加入GO與載藥微球組的成膠時(shí)間大幅縮短,抗壓強(qiáng)度提高近一倍,原因可能是由于GO的高模量片層狀結(jié)構(gòu)在凝膠中與載藥微球共同提供了應(yīng)力支撐.且3組凝膠皆未出現(xiàn)在4 ℃條件下轉(zhuǎn)變回溶膠態(tài)的現(xiàn)象,成膠效果穩(wěn)定.

圖3 VAN-PLGA/CS 微球的粒徑分布

表2 加入材料對凝膠成膠時(shí)間與機(jī)械強(qiáng)度的影響

Table 2 The relationship between different adding materials with gluing time and mechanical strength

處理方法凝膠時(shí)間/s抗壓強(qiáng)度/kPa空白CS凝膠1653.304±0.032加入載藥微球1573.660±0.055加入GO與載藥微球1306.398±0.295

2.4 支架降解測定及體外釋放實(shí)驗(yàn)

隨著降解時(shí)間延長,凝膠材料的質(zhì)量逐漸減小.根據(jù)凝膠的降解情況(圖4),稱量其濕質(zhì)量所繪制的降解曲線(圖5)表示,凝膠在約第41天完全降解.但根據(jù)其藥物釋放曲線(圖6)卻發(fā)現(xiàn),凝膠完全降解的1周后(第48天),VAN仍在釋放,原因可能有兩種,一方面,凝膠降解后形成絮狀沉淀物和凝膠小塊,這些凝膠小塊仍在降解過程中；另一方面,凝膠降解后釋放出載藥微球,而載藥微球?qū)λ幬锏尼尫湃允怯幸欢ㄖ芷诘?所以在第48天,測得VAN的藥物回收率約為68.6%.

圖4 凝膠的降解情況

圖5 凝膠的降解曲線

圖6 藥物的釋放曲線

3 討論

慢性骨髓炎的治療是現(xiàn)今臨床上的一個(gè)巨大挑戰(zhàn),因許多病例會(huì)出現(xiàn)肉芽組織或瘢痕.石墨烯作為碳納米材料應(yīng)用于骨組織工程材料還有一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢,如人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可識(shí)別獨(dú)立的碳納米管并沿著碳納米管的排列方向生長,細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出取向性的紡錘形態(tài),而且其成骨分化作用得到增強(qiáng)[22].這樣可以使細(xì)胞有序生長,減少患處瘢痕的形成.在可降解的載藥溫敏凝膠中加入石墨烯材料,可以實(shí)現(xiàn)局部抗炎、抗菌、促成骨、預(yù)防瘢痕等多種治療效果.

材料成膠時(shí)間約為130 s,在注入患處后,體溫條件下成膠迅速,根據(jù)殼聚糖溫敏水凝膠材料的特性,可以考慮應(yīng)用時(shí)采用燈光輻照加溫等措施,在保持細(xì)胞活性的前提下,適當(dāng)提升溫度,可以使凝膠成膠的速度進(jìn)一步縮短:在120 r/min的轉(zhuǎn)速下,其降解時(shí)間為41 d,在凝膠全部降解后,剩余的微球材料仍可以緩慢釋放藥物.凝膠孔隙均勻,表面粗糙,適宜細(xì)胞粘附及長入.根據(jù)此類制備方法,可以考慮遞送促成骨因子等其他治療藥物,實(shí)現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用.材料的降解時(shí)間比預(yù)期稍短,推測其原因?yàn)檗D(zhuǎn)速設(shè)置較大,設(shè)置此轉(zhuǎn)速的主要原因是凝膠材料在體內(nèi)比在體外降解的速度更快些[23].后續(xù)可以進(jìn)一步研究凝膠材料的細(xì)胞毒性,體內(nèi)降解時(shí)間以及最佳載藥量等特性,以期獲得更加適于在骨組織工程中應(yīng)用的材料.

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)中所制備的溫敏水凝膠材料,成功實(shí)現(xiàn)了對載藥微球的包裹,其制備過程簡單,因加入了氧化石墨烯,其抗壓強(qiáng)度相對于單純的殼聚糖水凝膠材料有大幅提升，成膠相對迅速,孔隙度良好,為后續(xù)進(jìn)一步探索提供了依據(jù).