健脾活瘀方抑制IL-6/JAK1/STAT3信號通路抗胃癌前病變的機制研究

郭敏，王曉鴿，楊國紅*，曾震軍,劉香麗,彭小利，張樾亞

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

胃癌前病變(Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)是指萎縮性胃炎伴腸化生(IntestinalMetaplasia,IM)和異型增生(Dysplasia,Dys)的一種狀態(tài)，是胃黏膜由正常向癌變轉(zhuǎn)化的一個重要病理階段。因此有效的逆轉(zhuǎn)胃癌前病變是降低胃癌發(fā)生率和病死率的重要措施[1]。“炎-癌”轉(zhuǎn)化理論在癌癥中的作用越來越受到重視[2]，胃癌前病變向胃癌轉(zhuǎn)化過程中，炎癥是一個促進因素。研究發(fā)現(xiàn),炎性因子白介素6(IL-6)介導(dǎo)的JAK1/STAT3通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[3-6]。因此有效的干預(yù)IL-6/JAK1/STAT3信號通路有可能成為逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的關(guān)鍵。

本課題組經(jīng)過前期大量臨床研究表明[7]，健脾活瘀方治療胃癌前病變療效確切，具有減輕炎癥反應(yīng)、改善胃黏膜血流、降低氧自由基損傷、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)控細(xì)胞增殖分化的作用，但其具體機制尚不清楚。本研究通過建立胃癌前病變大鼠模型，以“炎-癌”轉(zhuǎn)化為切入點，基于IL-6/JAK1/STAT3通路進一步探討健脾活瘀方防治胃癌前病變的作用機理?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(110±20)g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)2015-0004。本動物實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn)，符合實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 藥物及試劑

健脾活瘀方由四川新綠色藥業(yè)提供。組方:黨參15 g (批號:16100039),白術(shù)20 g(批號:16070098),茯苓20 g(批號:16070032),清半夏10 g(批號:16100135),陳皮10 g(批號:16100191),砂仁10 g(批號:17030139),木香15 g(批號:16100109),莪術(shù)15 g(批號:16120105),生薏苡仁30 g(批號:16100168),靈芝20 g(批號:16040057),三七粉3 g(批號:1610046),炙甘草6 g(批號:16040128)。

替普瑞酮[衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號:1606030];大鼠白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔多抗甘油醛-3-3磷酸脫氫酶(GAPDH)(杭州賢至生物有限公司)；鼠單抗JAK1(133 KD)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；兔多抗SOCS3(25 KD)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白marker(10～250 KD)(海利克思)。

1.3 儀器

顯微鏡(LEICA DM4000)；切片機(LEICA RM2245)；包埋機(LEICA EG1150H)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE)；全自動酶標(biāo)儀(美國,MDSpectraMax i3)；電泳儀(北京六一儀器廠)；電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；酶標(biāo)儀(美國，MDSpectraMax i3)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；實時熒光定量PCR儀(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

1.4 動物模型制備

除正常組外，余組采用單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)、乙醇、雷尼替丁、0.9%氯化鈉綜合造模，造模時間30周[8]。將體質(zhì)量(110±20)g的SD雄性大鼠隨機分成2組，其中對照組15只，實驗組75只，分籠飼養(yǎng)于通風(fēng)、光照12 h/12 h的房間里,室溫16 ℃～25 ℃，相對濕度50%～70%。對照組給予0.9%氯化鈉灌胃，每次2 mL，每日1次；實驗組給予MNNG、乙醇、雷尼替丁、0.9%氯化鈉綜合造模，造模時間30周。第1～8周；灌服45%乙醇,每只2 mL,每周1次；第1～30周,給予雷尼替丁(0.03 g/kg)灌胃；雷尼替丁用0.9%氯化鈉溶解,每次2 mL，每日1次，灌服乙醇當(dāng)天不再進行雷尼替丁灌胃；MNNG用去離子水配成1 g/L的儲備液,每周配制1次，于4 ℃冰箱避光保存，用前稀釋為80 μg/mL濃度的溶液，裝入用黑膠袋包裹的避光飲水瓶內(nèi)給大鼠自由飲用，每日更換1次藥液，直到造模第30周結(jié)束，各組處死動物取胃黏膜進行病理染色確定造模是否成功。造模期間每周稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。

1.5 分組及給藥方法

將SD大鼠按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、替普瑞酮組(15.6 mg/kg)和健脾活瘀方高、中、低劑量組，每組8只大鼠。依據(jù)丁虹主編《實驗藥理學(xué)》中人與動物每千克體重劑量折算法，高、中、低劑量組分別將健脾活瘀方用純凈水配成濃度為5.04 g/mL、2.52 g/mL、1.26 g/mL的混懸液(相當(dāng)于50.4 mg/kg、25.2 mg/kg、12.6 mg/kg)，用藥劑量為1 mL/(100 g·d)；模型組灌服同體積的純凈水1 mL/100 g。各組大鼠灌胃均每日1次，給藥時間為10周。末次給藥24 h 后，采大鼠腹主動脈血，分離血清，-80 ℃超低溫保存；頸椎脫臼處死大鼠后，剖腹取胃，沿胃大彎剖開胃，用預(yù)冷的PBS漂洗，-80 ℃超低溫保存。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察胃組織病理學(xué)變化

胃竇取材多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測血清中IL-6的水平

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的步驟進行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，加樣，溫育，加抗體等操作，最后在450 mn波長下用酶標(biāo)儀測量各孔的OD值。

1.6.3 PCR定量檢測胃黏膜組織中JAK1及STAT3 mRNA的表達(dá)

引物序列見表1。用Trizol法提取總RNA，取2 μL RNA分光光度計測定其OD260、OD280檢測其濃度及純度，以檢測RNA的完整性。用cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 ，60 ℃ 30，40 cycles，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

表1 引物序列

1.6.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測胃黏膜組織JAK1、STAT3、SOCS3、c-Myc、Survivin的蛋白表達(dá)

組織總蛋白抽提，BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性10 min，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h。分別加入JAK1抗體(1∶2 000)、STAT3抗體(1∶2 000)、SOCS3抗體(1∶500)、c-Myc 抗體(1∶2 000)、Survivin抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h，洗膜。ECL發(fā)光，蛋白質(zhì)印跡成像系統(tǒng)中顯色，照相，BandScan分析膠片灰度值，計算蛋白條帶相對灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗各組數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性時用LSD法，方差不齊時用Tamhane′s法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理形態(tài)學(xué)觀察比較

見圖1。HE染色結(jié)果顯示，正常組：胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，由表面上皮及固有層組成，胃小凹由表面上皮內(nèi)陷形成，胃小凹上皮與固有腺體的比例正常，固有腺體的層次與數(shù)目正常，腺體排列有極向，細(xì)胞無異型。模型組：胃黏膜局部病變呈中度異型增生(腺體排列紊亂，細(xì)胞核漿比增高，可見核分裂象)，周圍胃黏膜呈輕-中度萎縮性炎(固有腺體層次及數(shù)目輕-中度減少)。健脾活瘀方高劑量組：大鼠胃黏膜呈粉紅色，胃黏膜完整，偶見炎細(xì)胞浸潤。健脾活瘀方中劑量組:呈輕度萎縮。健脾活瘀方低劑量組:呈輕度異型增生。替普瑞酮組:呈輕度萎縮，未見明顯異型增生。

注：A：正常組，腺體的層次和數(shù)目正常；B：模型組，腺體呈中度異型增生，黑色三角示病理性核分裂像；C：健脾活瘀方高劑量組，胃黏膜大致正常，少量炎細(xì)胞浸潤；D：健脾活瘀方中劑量組，胃黏膜輕度萎縮；E：健脾活瘀方低劑量組，胃腺體呈輕度異型增生；F：替普瑞酮組，胃黏膜輕度萎縮。圖中黑色箭頭示胃黏膜腺體。圖1 健脾活瘀方對胃癌前病變大鼠胃黏膜形態(tài)的影響(HE染色，×200)

2.2 血清中IL-6的濃度比較

見表2。與正常組比較，模型組血清中IL-6的濃度均顯著升高(P<0.05)，正常組、替普瑞酮組及健脾活瘀方各劑量組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，各組血清中IL-6的濃度均顯著降低(P<0.05)；健脾活瘀方各劑量組之間及與替普瑞酮組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與正常組比較，1)P<0.05；與模型組相比，2)P<0.05；與替普瑞酮組比較，3)P<0.05。

2.3 胃黏膜組織中JAK1、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較

見表3。與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中JAK1 mRNA及STAT3 mRNA水平均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，健脾活瘀方高、中、低劑量組及替普瑞酮組的JAK1 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，健脾活瘀方高、中劑量組及替普瑞酮組的STAT3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與替普瑞酮組比較，健脾活瘀方高劑量組的JAK1 mRNA及STAT3 mRNA表達(dá)水平無差異，但健脾活瘀方中劑量組及低劑量組JAK1 mRNA及STAT3 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。

表3 各組胃黏膜組織中JAK1、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與模型組相比，2)P<0.05;與替普瑞酮組相比，3)P<0.05。

2.4 胃黏膜組織中JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc、SOCS3蛋白表達(dá)的比較

見圖2、表4。與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，而SOCS3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，健脾活瘀方高、中劑量組及替普瑞酮組的JAK1、STAT3及c-Myc蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，健脾活瘀方高、中、低劑量及替普瑞酮組的Survivin的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，健脾活瘀方高、中、低劑量組及替普瑞酮組的SOCS3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與替普瑞酮組比較，健脾活瘀方高、中劑量組的JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc、SOCS3蛋白表達(dá)含量比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：A：正常組；B：健脾活瘀方高劑量組；C：健脾活瘀方中劑量組；D：健脾活瘀低劑量組；E：替普瑞酮組；F：模型組。圖2 各組胃黏膜組織中JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc及SOCS3蛋白表達(dá)的比較

表4 各組大鼠胃黏膜組織中JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc、SOCS3蛋白含量比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與模型組相比，2)P<0.05;與替普瑞酮組相比，3)P<0.05。

3 討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2009年統(tǒng)計，胃癌發(fā)病人數(shù)及病亡人數(shù)均占全球胃癌發(fā)病總?cè)藬?shù)的50%左右。因其病因不明，實施一級預(yù)防比較困難，故目前主要對胃癌進行二級預(yù)防, 逆轉(zhuǎn)胃癌前病變, 阻斷其向胃癌的發(fā)展, 是防治胃癌研究的關(guān)鍵。

目前認(rèn)為“炎-癌轉(zhuǎn)化”[9]在胃癌前病變向胃癌轉(zhuǎn)化這一過程中起關(guān)鍵作用：炎癥因子引起細(xì)胞增殖分化異常及其介導(dǎo)的機體抑癌基因失活、原癌基因激活，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。白介素6(interleukin-6，IL-6)是由多種組織和細(xì)胞所表達(dá)的一種炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)IL-6[10-11]受體與配體結(jié)合后，在胞漿結(jié)合JAK1引發(fā)自身和JAKs的酪氨酸磷酸化，活化的受體JAK1募集胞漿內(nèi)的 STAT3[12-16]并使其磷酸化，激活JAK/STAT途徑，而此通路的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。

在“炎-癌” 轉(zhuǎn)化的過程中，機體抑癌基因失活、原癌基因激活發(fā)揮著重要作用。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的雙重功能，是聯(lián)系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的重要因子。較多研究表明,Survivin[17-20]過表達(dá)與胃癌發(fā)生、惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。原癌基因 c-Myc[21]是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，是胃癌中被激活的癌基因之一。SOCS(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)[22]是JAK/STAT途徑中的一種細(xì)胞因子信號抑制物，對JAK/STAT起負(fù)反饋調(diào)控。IL-6/JAK1/STAT3通路被激活后，導(dǎo)致促癌基因Survivin、c-Myc的激活和抑癌基因SOCS的失活，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。

胃癌前病變在中醫(yī)學(xué)中屬于“胃痞”“胃痛”等范疇，國醫(yī)大師李振華教授提出“脾虛血瘀”是胃癌前病變的基本病機。健脾活瘀方以健脾活血為基本治療原則，針對胃癌前病變的基本病機。健脾活瘀方在香砂六君子基礎(chǔ)上加香附、莪術(shù)、薏苡仁、三七、靈芝組成。其中黨參、白術(shù)、茯苓、甘草益氣健脾；陳皮、半夏、砂仁和胃降逆；香附配陳皮、砂仁可疏肝理氣;莪術(shù)破血行氣[23-25]，與黨參白術(shù)相配而不損真氣；生薏苡仁滲濕健脾；靈芝益氣補中；三七粉祛瘀生新，通補兼用，共奏健脾益氣、活血化瘀之效。臨床應(yīng)用針對胃癌前病變療效顯著[26]，但對于其具體的作用機制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，健脾活瘀方高劑量組可逆轉(zhuǎn)萎縮及異型增生，高、中劑量組可以明顯降低血清IL-6水平，降低胃組織中JAK1、 STAT3 mRNA及蛋白的表達(dá)，降低胃黏膜組織中Survivin及c-Myc蛋白水平，提高SOCS3蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，健脾活瘀方干預(yù)胃癌前病變的的作用機制可能是通過抑制IL-6/JAK1/STAT3信號通路，上調(diào)抑癌基因SOCS3的表達(dá)、下調(diào)促癌基因 c-Myc、Survivin的表達(dá)，從而達(dá)到阻斷炎-癌轉(zhuǎn)化、起到治療胃癌前病變的作用。