內(nèi)服外用對(duì)口腔黏膜潰瘍大鼠模型作用及其對(duì)炎性介質(zhì)的影響

王振國(guó)，董秀華，賈穎

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 610500)

口腔潰瘍屬“口瘡”“口糜”“口疳”等證范疇[1]，指以周期性反復(fù)發(fā)作為特點(diǎn)的口腔黏膜局限性潰瘍性損害，多為圓形或橢圓形，有明顯的灼痛，一般于7～10日自行愈合，但該病反復(fù)發(fā)作，愈合欠佳，具有自限性、周期性等特點(diǎn)，給患者生活帶來(lái)嚴(yán)重困擾，影響患者生活質(zhì)量[2]。目前，臨床上大多采用減輕緩解疼痛的原則進(jìn)行干預(yù)，并以預(yù)防復(fù)發(fā)為主。中醫(yī)臨床治療口腔潰瘍提倡內(nèi)外聯(lián)用，臨床常用的外用口腔潰瘍中成藥有冰硼散、錫類散、養(yǎng)陰生肌散等[3]。基于此，本實(shí)驗(yàn)以冰硼散外用聯(lián)合內(nèi)服三黃瀉心湯為基礎(chǔ)，探討內(nèi)服外用對(duì)口腔潰瘍(RAU)模型大鼠的治療作用并探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠50只，體質(zhì)量180 g～220 g，雌雄不限。購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司中心，合格證號(hào)：SCXK(川)2014-028。大鼠飼養(yǎng)溫度(25±2)℃,相對(duì)濕度55%～70%，符合要求。

1.2 主要試劑與儀器

瀉心湯：主要成分為大黃、黃連、黃芩；冰硼散(洛陽(yáng)寧竹藥業(yè)有限公司)；腫瘤生長(zhǎng)因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素10(IL-10)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、顯色劑DAB(南京建成生物工程有限公司)。

酶標(biāo)定量測(cè)定儀(Thermo Multiskan AsCant公司)；多功能照相顯微鏡(日本Olympus)；離心機(jī)5415D(Eppendorf公司，德國(guó))；超薄石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡)。

1.3 潰瘍模型建立

50只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為正常組(A)、模型組(B)、冰硼散組(C)、三黃瀉心湯組(D)、冰硼散+三黃瀉心湯組(C+D)共5組，各組10只。正常組進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，不予任何處理；B組、C組、D組、C+D組采用化學(xué)燒灼法建立口腔潰瘍動(dòng)物模型。方法：將大鼠固定，以1%戊巴比妥鈉(0.025 g/kg)麻醉，以蘸有NaOH晶體的濾紙(直徑3 mm)在下唇靠口角黏膜處燒灼5 s～8 s，生理鹽水沖洗，1天后形成潰瘍。每只動(dòng)物潰瘍面應(yīng)盡量在同一部位，大小、深度盡量一致[4]。其中C組、C+D組，給予冰硼散以覆蓋創(chuàng)面為度，D組及C+D組在以1 g/kg灌胃2 mL三黃瀉心湯藥液，A組與B組采用相應(yīng)體積生理鹽水灌胃，各組連續(xù)治療6 d。

每組10只大鼠，1只用于HE染色，剩余9只用于第6天ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-2、IL-10含量及其他課題組中涉及的考察指標(biāo)。

1.4 潰瘍組織HE染色

給藥6天后，各組大鼠隨機(jī)選取1只采用頸部脫臼法處死，剪下潰瘍組織，面積為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm，將剪下的潰瘍組織用磷酸鹽緩沖液PBS反復(fù)沖洗，清洗完成后置入4%多聚甲醛固定，24 h后將固定的組織置入自動(dòng)組織脫水機(jī)中進(jìn)行梯度酒精脫水、然后以二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋等步驟；經(jīng)組織切片(5 μm)、攤片、撈片、烤片后，脫蠟至水。蘇木精染色、鹽酸分化、再以流水沖洗，沖洗完成后用酒精脫水，使用伊紅溶液染色，使其上色便于拍照。最后再以梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，最后置于多功能照相顯微鏡下觀察、拍照[1]。

1.5 潰瘍的形成及愈合情況

實(shí)驗(yàn)期間，定期觀察并記錄潰瘍從發(fā)生至愈合的時(shí)間、潰瘍形狀及愈合狀態(tài)等，用游標(biāo)卡尺測(cè)量潰瘍的直徑并計(jì)算其面積，直至給藥結(jié)束。

1.6 炎性介質(zhì)的水平變化

給藥6天后，收集各組大鼠血清，采用考馬斯亮蘭法測(cè)定各炎性介質(zhì)的水平。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作，反應(yīng)終止后，在酶標(biāo)儀設(shè)置450 nm波長(zhǎng)，測(cè)量各孔的光密度(OD值)，檢測(cè)組織中炎性介質(zhì)TNF-α、IL-2、IL-10含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果比較

A組大鼠正常飼養(yǎng)，其口腔黏膜組織上皮完整、連續(xù)，細(xì)胞排列整齊、有序，胞核胞漿無(wú)異型性。B組大鼠，造模后不予給要處理，可看到其口腔黏膜被破壞，細(xì)胞排列，不規(guī)則，潰瘍呈圓形或橢圓形，潰瘍組織周圍邊緣充血、紅腫，同時(shí)黏膜的表面覆有灰黃或灰白色膜。C組、D組、C+D組在造模后進(jìn)行藥物干預(yù)，給藥6 d后，3組大鼠的潰瘍面積均呈縮小趨勢(shì)，同時(shí)有新生疤痕膜覆蓋，充血癥狀減輕，滲出物減少；聯(lián)合給藥(C+D組)的大鼠，潰瘍癥狀減輕程度大于C組或D組，并伴有部分新生肉芽產(chǎn)生。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠口腔黏膜組織病理染色(HE，×100)

2.2 各組潰瘍面積變化情況比較

具體數(shù)據(jù)如表1所示，與模型組比較，給藥第1天，各給藥組潰瘍面積均無(wú)明顯變化，從第2天起，各給藥組的口腔面積均較模型組有所減小，且隨時(shí)間逐漸好轉(zhuǎn)，到給藥第6天，各給藥組與模型組比較，口腔潰瘍面積均顯著縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；但C組、D組之間無(wú)明顯差異，C+D組較C組或D組均有顯著改善，異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠潰瘍面積變化

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，￥P<0.05。

2.3 各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10含量比較

各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10水平的變化見(jiàn)表2。給藥后6 d，與空白組比較，模型組與各給藥組的炎性因子TNF-α、IL-2、IL-10含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組的炎性因子TNF-α、IL-2、IL-10水平顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)；其中，C+D組(內(nèi)服+外用組)的炎性因子水平顯著低于C組/D組(內(nèi)服或外用)(P<0.05)。

表2 各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10的水平變化

注：與空白組比較，☆☆P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，￥P<0.05。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為口腔潰瘍屬“口瘡”范疇，口瘡的產(chǎn)生主要是由外感邪熱、心脾積熱；或陰虛陽(yáng)亢、虛陽(yáng)浮越等造成的虛火上浮或邪熱上蒸導(dǎo)致[5-7]，病程纏綿難愈。三黃瀉心湯主要由大黃、黃連、黃芩組成，三者均具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。現(xiàn)代藥理研究顯示，黃連的主要成分(小檗堿型化合物)，在分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上均屬異喹啉類生物堿，具季銨基團(tuán)。在抗炎方面，三黃瀉心湯具有較好的療效[8]。冰硼散，由玄明粉、硼砂、朱砂粉、冰片組成，具有清熱解毒、消腫止痛、祛腐生肌的作用，主治咽喉口齒新久腫痛及久嗽痰火，音啞咽痛，為口齒及喉科要藥[9]。內(nèi)服外用使用能達(dá)到雙倍的功效，加快發(fā)揮消腫止痛、清熱收斂的功效，使?jié)兊弥?。口腔黏膜直接灼傷，熱邪日久損傷正氣，形成局部津液不足，臨床表現(xiàn)為口腔潰瘍、咽喉紅腫熱痛、口干等陰虛內(nèi)熱之象?；诖?，本課題以外用冰硼散與內(nèi)服三黃瀉心湯聯(lián)用的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，探討其治療作用及部分抗炎機(jī)制。

炎性介質(zhì)IL-2是輔助性T細(xì)胞所分泌的重要淋巴因子之一，IL-2已成為機(jī)體免疫系統(tǒng)中極為重要的抗腫瘤、抗感染、抗衰老介質(zhì)[10]。研究顯示，IL-2可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞活性，有調(diào)節(jié)免疫功能作用，調(diào)控組織修復(fù)過(guò)程，有益于創(chuàng)傷修復(fù)，促進(jìn)口腔潰瘍愈合[11]。IL-2活性水平降低會(huì)導(dǎo)致免疫網(wǎng)絡(luò)中的某一環(huán)節(jié)或某些環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，以致造成機(jī)體免疫功能異常而導(dǎo)致發(fā)病。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠IL-2活性水平明顯下降，各給藥組的IL-2水平均較模型組有所升高，表明口腔潰瘍大鼠輔助性T細(xì)胞功能低下，給藥后，功能增強(qiáng)，說(shuō)明輔助性T細(xì)胞功能低下可能是口腔潰瘍發(fā)病的一個(gè)重要原因。

炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-10是參與口腔潰瘍形成過(guò)程中的具有代表性的主要炎癥細(xì)胞因子[12]，其水平高低與病情輕重密切相關(guān)，即潰瘍數(shù)目越多，潰瘍面積越大，TNF-α和IL-10含量越高[13]。炎性介質(zhì)IL-10主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，該介質(zhì)具有廣泛的促炎作用。本研究結(jié)果表明，C組或D組以及C+D組均能顯著抑制炎性介質(zhì)TNF-α、IL-10的水平；在不斷給藥過(guò)程中，潰瘍逐漸愈合，機(jī)體炎癥癥狀減輕炎性介質(zhì)水平明顯降低，且聯(lián)合用藥的潰瘍愈合能力優(yōu)于單獨(dú)外用或內(nèi)服。

綜上所述，對(duì)于口腔潰瘍的治療，可選擇內(nèi)服外用聯(lián)合用藥，對(duì)于減輕的癥狀，減少發(fā)病時(shí)間、有效抑制反復(fù)發(fā)作具有雙倍的作用。