鹽知母多糖的抗炎作用研究

賈小舟，蘇慧琳，曾元寧，王秋紅，匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)應(yīng)用與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)為百合科知母的干燥根莖。于春季和秋季采挖，除去其根須和表面附著泥沙，后曬干，習(xí)稱“毛知母”；或除其外皮并曬干[1]。知母作為臨床常用藥材歷史悠久，并且是許多常用中藥復(fù)方的組成成分。知母中活性成分主要包含有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、黃酮類、有機(jī)酸類、木脂素類、多糖類和微量元素等。知母皂苷類成分以甾體皂苷的數(shù)量最多，含量最高。而知母中含有最多的成分為多糖組分，是知母的重要物質(zhì)組成。以往對(duì)知母的研究大多關(guān)注了知母原藥材的小分子組成,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)知母糖類化合物進(jìn)行了深入的研究,結(jié)果表明知母多糖具有明顯的降血糖作用[2]、抗炎作用[3]、利水通便[4]和抗氧化的功能[5-6]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)知母小分子的炮制改變并不明顯，而鹽炙炮制后的藥材產(chǎn)生了活性更高、分子量減少，含蛋白量較低的多糖。本文探討鹽炙后——鹽知母多糖對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抗炎作用的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 藥物與試劑

鹽知母多糖(自制)：取鹽知母100 g，分別以8倍蒸餾水提取2次，每次2 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮后，加95%乙醇，至乙醇終濃度為80%，靜置，過(guò)濾，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)交替洗滌，干燥得鹽知母多糖組分。

水合氯醛(批號(hào)：20180813);吲哚美辛腸溶片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)分別為MM-0132M1、MM-0040M1、MM-0163M1)；其余試劑皆為分析純。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)合格證號(hào)44007200067823。購(gòu)買動(dòng)物后，在室溫20 ℃～25 ℃實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio TeK)；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化株式會(huì)社);GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；ME802/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法

2.1 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

取昆明小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組各10只，分為正常組(空白組)、模型組(灌胃蒸餾水)、鹽知母多糖低、中、高劑量組(0.32、0.64、1.28 g/kg)和陽(yáng)性藥組(10 mg/kg吲哚美辛)。各組小鼠給藥體積均為1.0 mL/100 g。鹽知母多糖給藥劑量參考《中華人民共和國(guó)藥典》[1]成人每日用量，根據(jù)人體與小鼠的等效劑量折算系數(shù)換算成小鼠的劑量。每日給藥1次，連續(xù)5 d。末次給藥1 h以后，立即在小鼠左耳前后兩面分別涂抹二甲苯100 μL致炎造模，右耳不做任何處理。

2.2 耳腫脹度的計(jì)算

致敏30 min后稱重，4%水合氯醛麻醉小鼠，脫頸椎將其處死，沿耳廓剪下左右兩耳片，用7 mm直徑打孔器在同一部位打下圓耳片，用分析天平稱分別稱重，計(jì)算各組耳腫脹抑制率。

耳腫脹率(%)=[(左耳重量-右耳重量)/左耳重量]×100%

2.3 脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

致敏30 min后稱重，4%水合氯醛麻醉小鼠，脫頸椎將其處死，取脾與胸腺稱重,并計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量×10/體質(zhì)量

2.4 HE染色及觀察

剪下的小鼠左耳打孔取材稱重后，立即用4%多聚甲醛固定，做石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組耳組織中充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度的病理變化。

2.5 小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè)

致敏30 min后稱重，4%水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，脫頸椎將其處死，取血后置于離心管中，靜置至血液凝固，1 000×g離心15 min,吸出上清至1.5 mL離心管,放入-80 ℃冰箱備用,按試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6含量進(jìn)行測(cè)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間均數(shù)的比較，采用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)。以P≤0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鹽知母多糖對(duì)各組小鼠耳腫脹的影響

各實(shí)驗(yàn)組小鼠狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)前無(wú)差別，飲食飲水量基本穩(wěn)定，無(wú)精神萎靡或死亡，體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯差異。與空白組相比，模型組小鼠耳腫脹率為52.09%，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功。與模型組比較，鹽知母多糖低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組，小鼠的耳腫脹率明顯降低,其中鹽知母多糖中、高劑量組和陽(yáng)性藥組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。鹽知母多糖低、中、高劑量組與陽(yáng)性藥組的耳腫脹率分別為45.26%，38.67%，34.06%，30.23%。給藥5 d后，鹽知母多糖能降低小鼠耳腫脹率，說(shuō)明鹽知母多糖對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹模型有抗炎消腫的作用。見(jiàn)表1。

表1 鹽知母多糖對(duì)小鼠耳腫脹率的影響

注：與空白組相比，##P<0.01;與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

3.2 鹽知母多糖對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組的體臟系數(shù)明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽知母多糖低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組，小鼠的脾指數(shù)明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，鹽知母多糖低、中、高劑量組中胸腺指數(shù)降低，其中陽(yáng)性藥組對(duì)胸腺指數(shù)影響明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3.3 HE染色及觀察

200倍顯微鏡下觀察小鼠左耳廓局部組織切片可直觀的看出：空白組皮下結(jié)締組織排列緊密無(wú)水腫、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組較空白組耳組織明顯腫脹、肥大，說(shuō)明造模成功；陽(yáng)性藥組、鹽知母多糖中、高低劑量組均較模型組有不同程度的腫脹減少現(xiàn)象。結(jié)果顯示鹽知母多糖中、高劑量組有顯著的抗炎作用。見(jiàn)圖1。

表2 各組小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)比較

注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01,*P<0.05。

注：A:空白組;B:模型組;C:陽(yáng)性藥組;D:鹽知母多糖低劑量組;E:鹽知母多糖中劑量組;F:鹽知母多糖高劑量組。圖1 耳組織HE染色(HE，×200)

3.4 鹽知母多糖對(duì)小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表示造模成功；與模型組比較，鹽知母多糖中、高劑量組均能顯著降IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，且成量效關(guān)系，這也可能是鹽知母多糖發(fā)揮抗炎作用的原因之一。見(jiàn)表3。

表3 鹽知母多糖對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子的影響

注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

4 討論

本文選擇二甲苯為致炎因子，使小鼠耳廓局部毛細(xì)血管通透性增加，誘導(dǎo)耳腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，該模型操作簡(jiǎn)單，見(jiàn)效快且易復(fù)制成功[7-9]。通過(guò)觀察鹽知母多糖對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響后發(fā)現(xiàn)，鹽知母多糖中、高劑量組對(duì)小鼠耳腫脹度較模型組能明顯降低，且有藥物濃度的增加，腫脹程度降低的趨勢(shì)。脾是機(jī)體最大的免疫器官，是免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所之一，可以制造免疫球蛋白等免疫物質(zhì)，直接反映機(jī)體的免疫功能[10]。灌胃給藥后，鹽知母多糖低、中、高劑量組可使小鼠的脾指數(shù)明顯降低,說(shuō)明鹽知母多糖可以降低二甲苯所致小鼠耳腫脹的免疫功能。從耳組織HE染色切片觀察，同模型組相比，鹽知母多糖中、高劑量腫脹程度明顯降低，炎性浸潤(rùn)細(xì)胞減少，同時(shí)小鼠血清中免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α也明顯下降，可見(jiàn)鹽知母多糖具有抗炎消腫作用，同時(shí)改善血清中免疫因子水平，從而發(fā)揮抗炎作用。本研究為今后鹽知母多糖抗炎機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為鹽知母多糖的進(jìn)一步研究提供一定的參考意義。