不同鹽度和堿度對卡拉白魚精子活力和受精率的影響

王信海,姜愛蘭,藺玉華,吳學軍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 宿遷農(nóng)科所,江蘇 宿遷 223800)

卡拉白魚(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)隸屬鯉科、雅羅魚亞科、卡拉白魚屬[ 1],具有肉質細嫩、味鮮美,抗病性強和耐鹽堿等優(yōu)良性狀,成為中亞地區(qū)珍貴的經(jīng)濟魚類。為了改善我國鹽堿水域的生產(chǎn)性能,增加養(yǎng)殖優(yōu)質魚類,我國于2000年從烏茲別克斯坦引進了卡拉白魚。20年以來,科研工作者經(jīng)過堅持不懈的努力和辛勤工作,卡拉白魚的引進、繁殖和養(yǎng)殖獲得了成功,并在鹽堿地推廣,取得了可喜的成效。然而,卡拉白魚是小型經(jīng)濟魚類,懷卵量較低,至今尚未形成規(guī)模化生產(chǎn)。

目前,國外關于卡拉白魚的研究文獻很少,僅見塔氏卡拉白魚(Chalcalburnustarichi)的氨、尿素代謝研究及適應高鹽堿生活史的報道[2—3]。國內(nèi)學者已完成了卡拉白魚養(yǎng)殖生物學、營養(yǎng)學和某些繁殖生理方面的研究[4—8]；然而,尚未見其精子活力的研究報道。魚類精子的激活與離子和pH值有關[9]。精子的活力直接影響受精率。因此,研究鹽度和堿度對卡拉白魚精子活力及受精率的影響,對其苗種的規(guī)?；a(chǎn)以及鹽堿水域資源的開發(fā)和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 親魚來源

2018年4～5月的供試卡拉白魚取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所繁育基地，為3齡魚，體長(17.87±1.21)cm,體質量(72.59±6.53)g。每個實驗組供試3尾魚,實驗結果為3尾魚的平均值。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同鹽度、堿度溶液的配制 NaCl、NaHCO3溶液以去離子水為溶劑,稱取分析純氯化鈉和碳酸氫鈉。依次配制鹽度處理組濃度系列:0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/L;依次配制堿度處理組濃度系列：0、10、15、25、40、50、60、70 mmol/L。

1.2.2 精液采集 選取健康、體表鱗片完整的性成熟雄魚,進行人工催產(chǎn)。催產(chǎn)藥物為寧波生物制藥三廠生產(chǎn)的魚類催產(chǎn)激素。催產(chǎn)藥物及劑量為促黃體釋放激素(LRH—A2)2 μg/kg、馬來酸地歐酮(DOM)1mg/kg和絨毛膜促性腺激素(HCG)0.9 mg/kg。在雄魚腹部注射催產(chǎn)劑1次；在水溫23～25 ℃下于10：00～14：00取精液。采精時,先擦干受試魚的生殖孔,輕壓腹部,用1 mL注射器抽取精液,抽取的精液呈乳白色,無血、尿、糞便和粘液的污染。將精液與鹽溶液按1∶200的比例稀釋混合。抽取20 μL的精子混合液,滴于載玻片上,使用10×10倍的顯微鏡進行觀察，觀察結果以1個視野為準。精子活力計時從精子滴入鹽液混合開始。在顯微鏡的視野中,依照精子運動的數(shù)量大致分為100%、70%、50%、30%、5%階段。精子活力的等級劃分參考吳景貴的標準[10](略加改進)。大約100%精子激烈運動是指精子被激活后呈漩渦狀運動;70%精子快速運動是指精子呈直線運動至轉入中速運動前;當視野中絕大多數(shù)精子停止活動時計算壽命(即5%精子的運動時間)。室內(nèi)觀察溫度為24～26 ℃。

1.2.3 人工受精與受精率的測定 取精液，將其覆蓋于卵上,用羽毛攪拌1 min,使精卵充分接觸；再以注射器抽取魚卵，將其撥入各實驗組溶液的三角瓶中受精。將受精卵搖晃10～15 min,在卵粒不粘瓶壁后,將受精卵倒入各組培養(yǎng)皿,每組50～100粒卵。在受精卵發(fā)育至囊胚后期統(tǒng)計受精率[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示；采用單因素方差分析法進行多重比較，以檢驗不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl鹽度溶液中精子的活力

由表1可知,當NaCl的質量濃度范圍為0～7 g/L時,卡拉白魚大約100%精子的激烈運動時間達13.67～22.00 s,70%精子的快速運動時間達21.80～31.93 s,精子的壽命為59.10～150.3 s。

表1 卡拉白魚精子在不同NaCl質量濃度中的活力

注:同列數(shù)據(jù)后標有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)。下同。

在NaCl質量濃度0～5 g/L的范圍內(nèi),隨著鹽度的升高,卡拉白魚精子的快速運動時間和壽命逐漸延長；當鹽度為4 g/L時,精子的快速運動時間和壽命最長,分別為31.93和150.3 s;當NaCl質量濃度為6 g/L以上時,精子活力開始下降;當NaCl質量濃度為8 g/L時,精子的快速運動時間僅有17.60 s,壽命只有77.67 s;當NaCl質量濃度達到9 g/L時,精子只是在原地顫動,在加入去離子水后又開始運動;當NaCl質量濃度為10 g/L時,精子很快死亡,即使再放入去離子水中,精子也不能被激活。實驗結果表明:卡拉白魚精子在NaCl濃度為4～5 g/L時,70%精子的快速運動時間和壽命顯著長于其他各組的(P<0.05)。在魚類的受精過程中,只有70%快速運動精子可以穿過卵膜,具有與卵結合的能力。由此可見,卡拉白魚精子受精的最適宜NaCl濃度為4～5 g/L。

2.2 不同濃度NaHCO3溶液中精子的活力

表2顯示,卡拉白魚精子在堿度0～70 mmol/L范圍內(nèi)均有活力。當實驗液堿度在0～10 mmol/L范圍內(nèi)時,精子的快速運動時間和壽命最長,分別為22.00～22.67 s和59.56～60.67 s;當堿度為15 mmol/L以上時,精子的快速運動時間和壽命顯著下降(P<0.05);當堿度為70 mmol/L時,精子的激烈運動時間只有3.33 s，快速運動時間只有8.33 s，壽命只有34.00 s，均為最低(P<0.05)。

2.3 鹽度和堿度對卡拉白魚受精率的影響

由圖1可見：當NaCl濃度為3 g/L時,卡拉白魚卵的受精率高達89.43%;當鹽度大于4 g/L時,受精率出現(xiàn)下降;當鹽度為7 g/L時,受精率僅為10.34%。

不同質量濃度的NaHCO3溶液對卡拉白魚受精率的影響如圖2所示。與堿度0 mmol/L組相比，堿度10、15 mmol/L組的卡拉白魚受精率分別下降了7.48和8.91個百分點(P>0.05);當堿度為25 mmol/L時,受精率降至42.57%(P<0.05);當堿度為70 mmol/L時，受精率為0%。

標有不同字母的數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。下同。

3 討論

3.1 鹽度對魚類精子活力的影響

在通常情況下,魚類精子在精巢和精漿中是不活動的,只有當精子被排到體外并被外界溶液稀釋后才能活動(即激活),精子抑制和激活與滲透壓、離子、pH值有關[9]。鹽度通過離子作用和滲透壓調節(jié)影響CAMP—ATP—Mg2+系統(tǒng)的運行,進而影響精子鞭毛的活動[12—13]。在鹽度相對較低的溶液中,精子內(nèi)ATP的產(chǎn)生和消耗在一段時間內(nèi)可達到平衡,因此精子能夠維持較長壽命;而在高鹽濃度的溶液中,ATP酶活性被抑制,從而使精子活力下降[14]。在本研究中,卡拉白魚精子在NaCl溶液濃度為0～5 g/L時,精子活力隨鹽度的升高而升高,當NaCl濃度為4～5 g/L時,精子的快速運動時間和壽命最長，這與徐敏等[16]和丁辰龍等[17]對大鱗鲃精子的研究結果相同。當溶液中NaCl濃度大于8 g/L時,精子活力明顯降低。當NaCl濃度超過10 g/L時,精子會全部死亡,這可能是因為溶液與精子細胞質間的滲透壓相差太大,精子自身的能量全部用于調節(jié)滲透壓,能量消耗殆盡而亡；也可能是由于滲透壓太大,直接導致精子的細胞結構受損而死亡[15]。此外,方正鯽(CarassiusauratusGibelio)和松浦鏡鯉(Cynipuscarpio)的精子在鹽度3～5 g/L范圍內(nèi)活力最強[16]；廣東魴(Megalobramahoffmanni)的精子在鹽度1～5 g/L下較理想運動[18],這些研究結果與本實驗的適宜鹽度范圍基本相符。然而,鹽度對不同科、屬的淡水魚類精子活力的影響是有區(qū)別的，例如：胭脂魚精子的快速運動時間和壽命在鹽度6 g/L下最長[15]；鮭科魚類——虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鱘科魚類——西伯利亞鱘(AcipensersinensisGray)精子的最適鹽度分別為7.0 g/L和1.5 g/L[19—20]。

圖2 堿度對卡拉白魚精子受精率的影響

3.2 堿度對魚類精子活力的影響

魚類精子活力的激活還與pH值、K+、Ca2+、Mg2+等密切相關,多數(shù)魚類的精漿在中性或偏堿性的溶液中活力較高,在酸性溶液中活力降低或被抑制[9]。NaHCO3通過其分解產(chǎn)物(HCO3-和CO2)參與這些離子的運輸，從而對魚類的精子活力產(chǎn)生重要影響[21]。Dreanno等[22]發(fā)現(xiàn)CO2能抑制大菱鲆(Scophthalmusmaximus)精子的運動,這種抑制作用是不依賴pH值的。CO2可阻止精子的線粒體氧化磷酸化作用,使ATP含量降低,使鞭毛軸絲停止運動,在雄性生殖管道,因無氧環(huán)境,精子保持靜止狀態(tài);當精子被排到有氧的海水中時才被激活。Morisawa等[23，24]通過實驗,發(fā)現(xiàn)虹鱒和大馬哈魚的精子從精巢排到輸精管,精子活力的獲得與精液中HCO3-的增加和pH值的升高有關。

據(jù)任自達等[25]報道,當?shù)屯蓰}堿地池塘水的pH值在7.2～8.6、總堿度在14.28 mmol/L、總硬度在3.08 mmol/L、含鹽量在2.05 g/L以下時,養(yǎng)殖魚類(四大家魚)生長良好；當超過此范圍時,魚類的存活率和生長速度均會受到影響。姜秋俚等[26]研究了3月齡卡拉白魚對鹽堿的耐受性,結果表明:在不同NaHCO3質量濃度的水體養(yǎng)殖60 d后,堿度為6.47 mmol/L和10.64 mmol/L組的魚體重分別較對照組(1.47 mmol/L)增加了5.5%和7.5%;堿度為23.65 mmol/L對魚的生長無影響。本實驗在堿度0～10 mmol/L范圍內(nèi),卡拉白魚精子的快速運動時間和壽命最長；當堿度在15 mmol/L以上時,精子的活力顯著下降,這說明精子對堿度的耐受性小于幼魚。此外,本實驗堿度對卡拉白魚精子的活力未表現(xiàn)出單一的促進和抑制作用,這與徐敏等[16]對大鱗鲃精子活力的研究結果相符。這可能是因為在低堿度下,NaHCO3解離的CO2含量較低而主要表現(xiàn)出HCO3-對精子活力的促進作用；當堿度升高時,NaHCO3解離的CO2含量增加而主要表現(xiàn)出CO2對精子活力的抑制作用。

3.3 鹽度和堿度對魚類受精率的影響

鹽度和堿度是鹽堿水域的主要理化指標,不同魚類的繁殖對鹽度和堿度的要求各不相同[27]。多數(shù)研究表明:精子的活力與受精率有重要的關系,當精子活力強時,受精率也高[27,28]。精子在快速運動期間,受精率最強；當精子轉為慢速運動時,其受精能力大大減低；原地顫抖的精子不具備受精能力[27—29]。本實驗發(fā)現(xiàn),適于卡拉白魚受精的鹽度范圍為1～3 g/L,堿度范圍為0～10 mmol/L,其適宜的鹽度范圍比精子活力的適宜鹽度范圍3～5 g/L要低，這可能是因為魚類的卵子在胚胎發(fā)育過程中受到了鹽堿度的影響。王信海等指出:在實驗室條件下,卡拉白魚在NaCl質量濃度5 g/L、堿度23.65 mmol/L以下水體中生長良好[30]。這再一次說明幼魚對鹽度和堿度的耐受性高于精子對鹽堿的耐受性。因此,在內(nèi)陸鹽堿水域的魚類在繁殖期回到淡水中產(chǎn)卵和孵化,這是魚類生殖洄游的自然規(guī)律。