高糖對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞PINCH-1表達(dá)的影響

謝榮 張和平 劉曉惠 劉佳麗 李沁蕓

637000 南充，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(謝榮，張和平，劉曉惠，劉佳麗，李沁蕓)；637100 南充，川北醫(yī)學(xué)院(謝榮)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一，是多種因素共同參與作用的結(jié)果。其中，腎間質(zhì)纖維化在糖尿病腎損傷中作為一個(gè)獨(dú)立因素，可導(dǎo)致腎功能惡化，主要病理特點(diǎn)表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度聚集。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，它作為多蛋白體中的支架，通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞多種生物活性改變。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)ILK參與了糖尿病腎小球早期硬化、系膜細(xì)胞增生、ECM聚集、氧化應(yīng)激、足細(xì)胞損傷、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等多種信號(hào)通路，在糖尿病患者的腎臟損傷中發(fā)揮了重要作用[1]。PINCH-1(particulary interesting new cysteine-histicline rich protein-1)蛋白是ILK的專(zhuān)屬伴侶，在蛋白水平上可以調(diào)節(jié)ILK的活性，PINCH-1、ILK形成的PINCH-ILK-α-Parvin復(fù)合物在整合素信號(hào)的傳導(dǎo)中，介導(dǎo)細(xì)胞增生、黏附、ECM聚集[2-3]，是腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。但目前關(guān)于PINCH-1蛋白在DN的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察高糖刺激對(duì)大鼠腎臟成纖維細(xì)胞PINCH-1、ILK表達(dá)的影響，以及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、ECM相關(guān)蛋白分泌的影響，探索PINCH-1蛋白在DN發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

一、材料與試劑

正常大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株(NRK49F)購(gòu)自上海通派生物科技有限公司。H-DMEM、L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；兔抗大鼠PINCH-1多克隆抗體、兔抗大鼠ILK多克隆抗體、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體購(gòu)自Abcom公司；SP-免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司；PINCH-1引物、ILK引物、β-Actin引物、α-SMA引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司；大鼠FN、Col I ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%滅活胎牛血清L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK 49F細(xì)胞。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，每2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次。

2.實(shí)驗(yàn)分組與處理 實(shí)驗(yàn)前24 h將培養(yǎng)液換成L-DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞同步化。(1)高糖組用10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)作低糖組，分別取0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h的標(biāo)本(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)用含10%FBS的不同濃度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基，分成三組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.RT-qPCR檢測(cè)PINCH-1、ILK mRNA的表達(dá) TRIZOL提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)PINCH-1 mRNA、ILK、α-SMA mRNA表達(dá)水平。引物序列為：PINCH-1上游引物5′-TGGACATCGCCATTATGAGAGG-3′，下游引物5′-CAAGTGGAACAGGCAAAGCAG-3′，目的片段長(zhǎng)度162 bp；ILK上游引物5′-TACAAACAGACGCTCAGCAGACA-3′，下游引物5′-TGGTGGGATAGTAGGCCGAAG-3′，目的片段長(zhǎng)度145 bp；α-SMA上游引物5′-GAAGAGTTACGAGTTGCCTGATG-3′，下游引物5′ -ATGATGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3′，目的片段長(zhǎng)度138 bp；β-Actin上游引物5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′，目的片段長(zhǎng)度155 bp。real-time RT-PCR按照RocheFastStart Universal SYBR Green Master(ROX)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，相對(duì)基因表達(dá)采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

4.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化后，以1.0×105個(gè)/mL的密度接種到爬片上進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞化學(xué)染色時(shí)吸出培養(yǎng)液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，PBS清洗2 min×3次；0.3% Triton X-100浸泡5 min細(xì)胞破膜，PBS漂洗2 min×3次；3% H2O2封閉過(guò)氧化物酶10 min，PBS漂洗2 min×3次；正常山羊血清封閉20 min(室溫)；吸除多余的血清，分別滴加一抗，包括兔抗大鼠PINCH-1多克隆抗體(1∶200)、兔抗大鼠ILK多克隆抗體(1∶200)、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(1∶100)，放于濕盒中4 ℃冰箱過(guò)夜；常溫下復(fù)溫，PBS漂洗2 min×3次，吸除爬片上多余的液體，滴加生物素化山羊抗兔/小鼠IgG二抗，37 ℃，避光孵育20 min，PBS漂洗2 min×3次；吸除爬片上多余的液體，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，孵育20 min；DAB鏡下顯色3～5 min，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核約15 s，自來(lái)水沖洗；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照記錄并進(jìn)行蛋白半定量分析。

5.ELISA法檢測(cè)FN、Col I蛋白的表達(dá) 取出細(xì)胞爬片之前，收集各組細(xì)胞上清液，3 000 r/min 離心，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于波長(zhǎng)450 nm的全光譜分光光度計(jì)上讀取各孔的A值，檢測(cè)FN、Col I的蛋白含量。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以其均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、高糖刺激成纖維細(xì)胞不同的時(shí)間對(duì)PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA表達(dá)的影響

高糖刺激成纖維細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，分別以0 h作對(duì)照，低糖組PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。高糖組PINCH-1、ILK mRNA表達(dá)均在6 h后顯著增加，與低糖組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高糖組α-SMA mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性增加，在72 h達(dá)高峰(P<0.05)。(圖1、圖2、圖3)

圖1 高糖組和低糖組不同作用時(shí)間PINCH-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖2 高糖組和低糖組不同作用時(shí)間ILK mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖3 高糖組和低糖組不同作用時(shí)間α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量

二、不同濃度的葡萄糖刺激成纖維細(xì)胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的表達(dá)情況

不同濃度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)刺激成纖維細(xì)胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的表達(dá)呈濃度依賴(lài)性增加，高糖組(25.0 mmol/L)PINCH-1 mRNA表達(dá)量是低糖組(5.5 mmol/L)的(1.98±0.09)倍，高糖組ILK mRNA表達(dá)量是低糖組的(2.34±0.16)倍，高糖組α-SMA mRNA表達(dá)量是低糖組的(5.86±0.84)倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(圖4)

注：與5.5 mmol/L葡萄糖濃度組比較，aP<0.01圖4 不同濃度葡萄糖刺激成纖維細(xì)胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

三、高糖刺激成纖維細(xì)胞不同的時(shí)間PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達(dá)情況

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示正常大鼠腎臟成纖維細(xì)胞胞漿中PINCH-1、ILK蛋白呈低水平表達(dá)，α-SMA蛋白幾乎無(wú)表達(dá)。高糖刺激能明顯增加PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白表達(dá)，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)，呈一定遞增趨勢(shì)，高糖刺激成纖維細(xì)胞48 h時(shí)，PINCH-1蛋白水平達(dá)最高峰，刺激24 h時(shí)ILK蛋白水平達(dá)最高峰，刺激72 h時(shí)α-SMA蛋白水平達(dá)最高峰，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表1)

四、不同濃度的葡萄糖刺激成纖維細(xì)胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達(dá)情況

不同濃度葡萄糖(5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L)刺激成纖維細(xì)胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達(dá)均呈濃度依賴(lài)性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表2)

表2 不同濃度葡萄糖刺激NRK49F細(xì)胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較

注：與5.5 mmol/L葡萄糖組比較，aP<0.05，bP<0.01

五、高糖刺激成纖維細(xì)胞不同的時(shí)間FN、Col I的表達(dá)情況

ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示高糖刺激能明顯增加ECM主要成分FN、Col I蛋白的表達(dá)。高糖刺激成纖維細(xì)胞6 h后，F(xiàn)N蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性增加；高糖刺激成纖維細(xì)胞12 h后，Col I蛋白表達(dá)呈明顯遞增趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表3)

討 論

DN是糖尿病患者最主要的致死因素，是終末期腎臟病的常見(jiàn)病因。在糖尿病腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中，腎臟固有細(xì)胞發(fā)生功能和表型改變，轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀磉_(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，合成ECM能力顯著增強(qiáng)，α-SMA目前被認(rèn)為是預(yù)測(cè)腎間質(zhì)纖維化預(yù)后的最好指標(biāo)[4-5]。早期延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對(duì)DN的防治具有重大的意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(tansforming growth factor beta-1，TGF-β1)是成纖維細(xì)胞活化和腎間質(zhì)纖維化的重要啟動(dòng)和促進(jìn)因子。高糖刺激能夠促進(jìn)TGF-β1高表達(dá)，體外研究證實(shí)，在系膜細(xì)胞中，TGF-β1誘導(dǎo)的PINCH-1、ILK、α-parvin的表達(dá)增加，PINCH-1、ILK、α-parvin形成的PIP復(fù)合體增加，F(xiàn)N和ECM沉積明顯增加[6-7]。Kim等人[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導(dǎo)的早期，PINCH-1、ILK在系膜細(xì)胞的表達(dá)明顯增加，之后開(kāi)始下降，同時(shí)細(xì)胞周期抑制蛋白p27 Kip1的定位和Akt、p38磷酸化發(fā)生改變，推測(cè)TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)PINCH-1、ILK的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增殖和肥大。用TGF-β1刺激足細(xì)胞，PINCH-1、ILK形成的復(fù)合體下調(diào)，細(xì)胞凋亡蛋白酶-3活性增強(qiáng)，證實(shí)PINCH-1抑制足細(xì)胞凋亡[9]。Li等[10]證實(shí)，用外源性PINCH-1刺激腎小管上皮細(xì)胞，E-鈣黏蛋白表達(dá)下降，F(xiàn)N的表達(dá)明顯升高，PINCH-1在腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。在原發(fā)性腎小球腎炎腎組織中，PINCH-1的表達(dá)隨著腎間質(zhì)纖維化程度加重而進(jìn)行性增加，范圍增大[11]。這些研究表明PINCH-1在TGF-β1調(diào)控下，與ILK相互作用參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，在不同類(lèi)型的腎臟細(xì)胞中產(chǎn)生不同的效應(yīng)，影響細(xì)胞行為。

表1 高糖刺激NRK49F細(xì)胞不同時(shí)間PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組12 h比較，bP>0.05；與高糖組24 h比較，cP>0.05

表3 高糖刺激NRK49F細(xì)胞不同時(shí)間FN、Col I蛋白的表達(dá)量比較(μg/L)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，在低糖環(huán)境下，PINCH-1在NRK49F細(xì)胞中少量表達(dá)，α-SMA幾乎無(wú)表達(dá)，ECM主要成分FN、Col I呈低水平表達(dá)，在高糖刺激下，PINCH-1蛋白的表達(dá)較低糖組明顯增加，纖維化相關(guān)蛋白α-SMA、FN、Col I的表達(dá)持續(xù)增加，呈一定時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性，說(shuō)明高糖能夠促進(jìn)PINCH-1的表達(dá)，高糖刺激促進(jìn)腎臟成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，分泌大量的ECM成分。本研究進(jìn)一步證實(shí)PINCH-1參與早期高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激下，PINCH-1在NRK49F細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)到峰值后有所下降，但其機(jī)制尚不清楚。這一現(xiàn)象可能與PINCH-1在高糖刺激的NRK細(xì)胞中不同時(shí)期發(fā)揮的主要效應(yīng)不同有關(guān)，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活[9]。下一步的實(shí)驗(yàn)，將重點(diǎn)對(duì)此進(jìn)行深入研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，ILK在高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟成纖維細(xì)胞的表達(dá)，與PINCH-1的表達(dá)具有協(xié)同作用。ILK在高糖刺激下，呈一定時(shí)間依賴(lài)性增加，達(dá)到一定的峰值后，表達(dá)有所下降，而在不同葡萄糖濃度下，呈濃度依賴(lài)性增加。有研究證實(shí)，ILK和α-SMA在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞和鏈脲霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟組織中，表達(dá)明顯增加[12]，抑制ILK的表達(dá)，F(xiàn)N、α-SMA的表達(dá)均明顯下降，從而延緩高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。我們的研究結(jié)果與ILK在其它腎臟固有細(xì)胞的研究結(jié)果相符合，證實(shí)了ILK在DKD整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要地位。本實(shí)驗(yàn)中PINCH-1與ILK表達(dá)的一致性得到證實(shí)，為PINCH-1參與DKD的發(fā)病提供了更充分的依據(jù)。

結(jié)合近些年的研究，本課題組推測(cè)，在高糖刺激下，PINCH-1、ILK可能通過(guò)TGF-β1的調(diào)節(jié)表達(dá)上調(diào)，形成的PIP復(fù)合體促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，ECM大量聚積，參與DN患者腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。因此，PINCH-1可能成為未來(lái)治療DN的新靶點(diǎn)。