2019新型冠狀病毒實驗室檢測與預防研究

錢揚會 綜述，董建英 審校

北京京都兒童醫(yī)院：1.檢驗科；2.院辦，北京 102200

2019年12月湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)多起肺炎病例均診斷為冠狀病毒性肺炎/肺部感染，后來發(fā)現(xiàn)這種新型肺炎存在人傳人現(xiàn)象。國家衛(wèi)生健康委員會將這種被2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染導致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入法定傳染病乙類管理，采取甲類傳染病的預防、控制措施。目前，國內外醫(yī)療機構及學者對SARS-CoV-2診療及防控進行研究，取得了較多進展。本院作為北京市首批開設24 h發(fā)熱門診，并接收患兒的兒童醫(yī)院，在疾病的診療及防控方面具有一定的經(jīng)驗。本文主要介紹SARS-CoV-2的生物學特性、致病特點、實驗室檢測與預防。

1 SARS-CoV-2概述

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科，形態(tài)為圓形、橢圓形或輕度多形性，直徑為100～120 nm。人冠狀病毒有兩個血清型，即HcoV-229E和HcoV-OC43，是引起人呼吸道感染的重要病原體，人類20%的普通感冒由冠狀病毒引起，兒童的冠狀病毒感染發(fā)病率較低[1-2]。隨著細胞培養(yǎng)和分子生物學技術的迅速發(fā)展，臨床上對冠狀病毒的認識也逐步深入。

2 SARS-CoV-2的分子生物學特征

2.1SARS-CoV-2的基因組結構 近期，國內外多個研究團隊對SARS-CoV-2基因組進行研究，2020年1月22日，國家基因組科學數(shù)據(jù)中心正式發(fā)布SARS-CoV-2資源庫。該庫整合了WHO、中國疾病預防控制中心(CDC)、美國國家生物技術信息中心(NCBI)、全球流感序列數(shù)據(jù)庫(GISAID)等機構公開發(fā)布的SARS-CoV-2基因組序列數(shù)據(jù)、元信息、學術文獻、新聞動態(tài)、科普文章，通過對全基因組序列相似性比較和變異位點分析，獲取SARS-CoV-2病毒株之間、SARS-CoV-2病毒株與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒以及與類SARS冠狀病毒蝙蝠株之間的變異程度、變異區(qū)域、變異堿基的詳細信息。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，SARS-CoV-2與2003年爆發(fā)的SARS病毒基因組序列相似度為80%，與2017年2月從國內的蝙蝠中采集到的Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45基因組序列相似性最高，相似度為88%[3]。

2.2SARS-CoV-2病原學特點 SARS-CoV-2屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，為多形性，直徑60～140 nm[2]。體外分離培養(yǎng)時，SARS-CoV-2在96 h左右即可在人呼吸道上皮細胞內發(fā)現(xiàn)，而在Vero E6和Huh-7細胞系中分離培養(yǎng)需要6 d。SARS-CoV-2在進化樹上初步定位是β屬，與ZC45、ZXC21具有很高的同源性[4]。

3 SARS-CoV-2 臨床致病特點

基于目前的流行病學調查，COVID-19潛伏期為1～14 d，多為3～7 d，以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀。重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒，以及出血和凝血功能障礙等，值得注意的是重型、危重型患者病程中可表現(xiàn)為中低熱，甚至無明顯發(fā)熱。輕型患者僅表現(xiàn)為低熱、輕微乏力等，無肺炎表現(xiàn)[5]。

從目前病例情況看，多數(shù)患者預后良好，少數(shù)患者病情危重。老年人和有慢性基礎疾病者預后較差。兒童病例癥狀相對較輕。

4 SARS-CoV-2 的檢測方法

4.1標本的采集要求 (1)進行SARS-CoV-2感染標本采集的技術人員應經(jīng)過生物安全培訓(培訓合格)和具備相應的實驗技能，在標本采集過程中，采樣人員需穿著個人防護裝備(PPE)。(2)病例標本的采集由所在病區(qū)經(jīng)過培訓的醫(yī)護人員或在專業(yè)人員指導下完成。(3)根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可根據(jù)患者病程或研究需求多次采樣。(4)每個病例必須采集呼吸道標本，重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本(如支氣管或肺泡灌洗液、肺組織活檢標本等)，可根據(jù)臨床表現(xiàn)與采集標本的時間間隔決定采集。

4.2標本的采集種類 (1)上呼吸道標本：口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液。(2)下呼吸道標本：呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。(3)血清：應盡量采集急性期血清，建議使用真空采血管。

4.3標本的采集對象 (1)SARS-CoV-2感染疑似病例、疑似聚集性病例的患者。(2)其他需要進行SARS-CoV-2 感染診斷或鑒別診斷的患者。(3)其他需要進一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料(如溯源分析)。

4.4采集標本的包裝 (1)標本采集后應在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。(2)所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋、內有墊圈、耐冷凍的標本采集管里，擰緊，容器外注明標本編號、種類、姓名及采集日期。(3)將密閉后的標本放入大小合適的塑料袋內密封，每袋裝1份標本。

4.5采集標本的運輸 (1)SARS-CoV-2毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件《危險品航空安全運輸技術細則》分類包裝要求。(2)環(huán)境標本屬于B類，對應的聯(lián)合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件《危險品航空安全運輸技術細則》的分類包裝要求，通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘藴拾b。(3)SARS-CoV-2毒株或其他潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》執(zhí)行。

4.6采集標本的保存 用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，24 h內能檢測的標本可置于4 ℃保存，24 h內無法檢測的標本則應置于-70 ℃或以下保存(若無-70 ℃，則應置于-20 ℃暫存)。血清可在4 ℃存放3 d，可在-20 ℃以下長期保存。標本運送期間應避免反復凍融，并應設立專庫或專柜單獨保存標本。

4.7SARS-CoV-2實時熒光定量反轉錄PCR(RT-PCR)檢測 參照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第三版)》[6]和《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》[7]進行檢測。實時熒光定量RT-PCR檢測所用分子檢測引物與探針如下。

4.7.1靶標一(ORF1a/b) 正向引物(F)：CCC TGT GGG TTT TAC ACT TAA；反向引物(R)：ACG ATT GTG CAT CAG CTG A；熒光探針(P)：5′-FAM-CCG TCT GCG GTA TGT GGA AAG GTT ATG G-BHQ1-3′。

4.7.2靶標二(N) 正向引物(F)：GGG GAA CTT CTC CTG CTA GAA T；反向引物(R)：CAG ACA TTT TGC TCT CAA GCT G；熒光探針(P)：5′-FAM-TTG CTG CTG CTT GAC AGA TT-TAMRA-3′。

4.8檢測結果的判讀 陰性：無Ct值或Ct值為40。Ct值小于37，可報告為陽性。Ct值為37～40，建議重復試驗，若重做結果Ct值小于40，擴增曲線有明顯起峰，該標本判斷為陽性，否則為陰性。

RT-PCR能夠在不同的樣品中測定SARS-CoV-2的基因物質。總的來說，現(xiàn)有的PCR方法特異度較高，但是靈敏度較低。這就意味著陰性的測試結果并不能排除患者SARS-CoV-2的感染。同時，由于缺乏實驗室質量控制而導致的實驗室樣品污染，可能導致假陽性結果的出現(xiàn)。PCR結果可以輔助臨床診斷評價，但是不能確診或排除疾病。

到目前為止，醫(yī)生只能進行一般的病毒測試，然后必須對基因組進行排序和翻譯。設備齊全的大型實驗室能夠做到這一點，但對于規(guī)模較小的實驗室存在一定困難。德羅斯滕是SARS病毒的共同發(fā)現(xiàn)者之一，他認為SARS-CoV-2 與SARS病毒關系密切，擁有SARS控制標本庫存的實驗室可以用其診斷SARS-CoV-2，從而縮短創(chuàng)建測試所需的時間[8]。

5 SARS-CoV-2的生物安全防護[9]

根據(jù)目前了解的SARS-CoV-2 的生物學特性、傳播特性、致病性、臨床資料等信息，考慮到SARS-CoV-2具有感染聚集性發(fā)病且有重癥病例和死亡病例的特點，實驗室檢測應按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物對SARS-CoV-2 進行管理。

5.1病毒的培養(yǎng) 指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和實驗、活病毒及其蛋白的純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作，利用活病毒或其感染細胞(或細胞提取物)，不經(jīng)滅活進行的生化分析、血清學檢測、免疫學檢測等操作視為病原培養(yǎng)。上述操作應在生物安全三級(BSL-3)實驗室中進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同條件的實驗室或防護條件下進行。滅活后的病毒培養(yǎng)物可在BSL-2或 BSL-1實驗室操作。

5.2動物感染實驗 指以活病毒感染動物的實驗，應在BSL-3實驗室中進行操作。

5.3未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作 未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生物化學分析等操作，應在BSL-2實驗室操作，但個人防護應參照BSL-3實驗室的防護要求。

5.4滅活材料的操作 感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后可在BSL-1實驗室操作。

5.5無感染性材料的操作 指針對確認無感染性材料的各種操作，包括但不限于無感染性的病毒DNA的操作，可在BSL-1實驗室操作。

6 SARS-CoV-2感染期間實驗室防控[9]

6.1人員的個人防護 (1)工作人員嚴格按照清潔區(qū)、緩沖區(qū)、污染區(qū)的人流走向進入實驗室。(2)進入實驗室前須穿戴好個人防護用品，至少應佩戴帽子、口罩、手套，穿著工作服、工作褲和工作鞋。(3)所有標本均應視為具有潛在傳染性，須采取標準預防措施。(4)進入發(fā)熱門診或患者留觀室、病區(qū)時穿戴防護用品程序見圖1。(5)離開發(fā)熱門診或留觀室、病區(qū)前脫防護用品程序見圖2。

圖1 人員穿戴防護用品及進入污染區(qū)程序圖

圖2 人員離開污染區(qū)及脫防護用品程序圖

6.2實驗操作的防護 (1)呼吸道來源標本的操作：呼吸道來源標本應留取至密閉容器，用密閉轉運容器進行送檢，標本核收后應立即轉入二級生物安全柜，操作過程小心謹慎，防溢、灑、滲、漏，一旦發(fā)生溢、灑后按照消毒程序進行處置。(2)其他來源標本：在尚未明確非呼吸道來源標本是否具有傳染性的情況下，應將所有類型標本視為具有潛在危險性。(3)微量采血做到一人一針一管一消，對每位患者采血前后均應洗手和(或)手消。(4)離心標本應在安全柜中打開，離心機應蓋嚴蓋子，標本離心后應靜置5 min以上方可打開離心機蓋，如發(fā)生標本管破裂、溢、灑，應立即關閉離心機蓋，按照消毒程序進行處置。(5)流感病毒檢測的咽拭子標本被接收后，應在安全柜中檢測，檢測完畢置于醫(yī)療廢物盒中，并蓋嚴蓋子。(6)在現(xiàn)有實驗室條件下嚴禁進行SARS病毒毒株的分離鑒定和保存。

6.3實驗室的清潔與消毒

6.3.1空氣清潔消毒 首選自然通風，保證室內外空氣的流通。室內無人時使用紫外線燈照射消毒，每次照射不小于0.5 h，每天2～3次。

6.3.2物體表面、地面的清潔和消毒 實驗室所有的物體表面、地面都應當進行清潔，受到病原微生物污染時，應當先清潔，再進行消毒。

實驗室每天應使用500～1 000 mg/L的含氯消毒劑擦拭臺面、地面和物體表面，每天至少2次，遇污染時隨時消毒。

現(xiàn)階段可定時用1 000 mg/L健之素溶液擦拭臺面、地面、垃圾容器盒表面等。

6.3.3標本滲、漏、溢、灑的消毒 發(fā)生標本溢、灑、滲、漏后應立即用紙巾或抹布覆蓋，用75%的乙醇溶液或1 500～2 500 mg/L的有效氯溶液由外向內傾倒，作用30 min以上，用鑷子移去紙巾或抹布，用消毒液擦拭后再用清水擦拭。溢灑處應設置明顯標識，防止其他人員靠近。

6.3.4手部的清潔與消毒 流動水洗手，方法為非手觸式開關，方法為七步洗手法，每一步驟均為10 s，最后用清水沖凈清洗劑。手部的消毒劑采用75%的乙醇溶液或70%的異丙醇或醇的復合制劑3～5 mL，按洗手方法搓揉1～2 min。

6.3.5防護用品的清洗與消毒 非一次性使用的防護用品，放入專用轉運箱中，每周由專人送洗衣房進行清洗、消毒。防護眼鏡可以用500～1 000 mg/L的含氯消毒劑消毒，采用0.2%的過氧乙酸溶液或75%的乙醇溶液浸泡30 min，清洗干燥后備用。

6.3.6實驗器材的消毒與滅菌 非一次性使用的實驗器材應進行121 ℃、20 min的壓力蒸汽滅菌，不適用于壓力蒸汽滅菌的物品可采用化學消毒法，可用75%的乙醇溶液浸泡作用15～30 min，干燥保存。

6.4醫(yī)療廢物的處置

6.4.1醫(yī)療廢物的收集 醫(yī)療廢物應分類收集，并按照類別放置于防滲、防漏、防銳器的專用包裝物或密閉的容器內。醫(yī)療廢物專用包裝物、容器，應有明顯的中英文警示標識。

醫(yī)療廢物收集容器應符合有關部門的要求，所有廢物盛裝量不應超過容器或包裝袋的3/4。嚴禁使用有破損或已經(jīng)污染的收集容器，見圖3。

圖3 醫(yī)療廢物的收集流程圖

6.4.2 醫(yī)療廢物的轉運 醫(yī)療廢物應每日由專人使用專用轉運工具，按照規(guī)定的時間、路線及時清運，就近轉送到醫(yī)院醫(yī)療廢物專門暫存場

所，定期由醫(yī)療廢物集中處置單位轉運焚燒。運送工具、暫存場所等需及時清潔，遇污染時及時用1 000 mg/L的含氯消毒劑或0.2%的過氧乙酸溶液消毒。

對外運輸?shù)尼t(yī)療廢物必須做好交接工作，并認真記錄，內容包括醫(yī)療廢物的種類、數(shù)量、交接時間、集中處置單位以及經(jīng)辦人簽名。登記資料至少保存兩年。