雞蛋中氟蟲腈砜能力驗證樣品單元內(nèi)與單元間均勻性評價案例與模型分析

張會亮，程琳，高曉明，項新華，王海燕，孫磊，王聰

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

能力驗證（Proficiency Testing）是利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價參加者的能力。能力驗證樣品是能力驗證活動的載體，為了確保能力驗證中出現(xiàn)的不滿意結(jié)果不歸咎于樣品之間或樣品本身的變異，樣品應(yīng)是均勻和穩(wěn)定的［1］。

目前，我國的能力驗證計劃較多地使用穩(wěn)健統(tǒng)計法，基于參加者的結(jié)果確定指定值（X）和能力評定標(biāo)準(zhǔn)差（σ）。如2017 年國家認(rèn)監(jiān)委共組織47 項能力驗證項目［2］，其中31 項為定量檢測項目，定量檢測項目中有29 項使用了穩(wěn)健統(tǒng)計方式開展評價，占比近94%。在使用穩(wěn)健統(tǒng)計方式時，指定值隨著各參加者完成測定、得出結(jié)果而同步生成，樣品的穩(wěn)定性不會直接影響指定值。對穩(wěn)定性的評價主要是為防止樣品在發(fā)放后因運輸、儲存等原因發(fā)生降解，失去均勻性而影響評價。因此均勻性是能力驗證樣品的核心指標(biāo)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制與能力驗證這兩個領(lǐng)域均對樣品均勻性的作出要求。二者的規(guī)定基于共同原理，但能力驗證對樣品均勻性的規(guī)定較為簡化，主要包括對單元內(nèi)均勻性不作要求，對檢測方法的精密度不作要求、對樣品稱樣量無具體要求等，詳見表1。存在這種差異的原因在于，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用場景更廣，研制中期望“方法和實驗室能力都應(yīng)該代表‘最高水平’，并且它們應(yīng)能使其測量溯源到項目設(shè)計規(guī)定的測量標(biāo)準(zhǔn)”［3］；而能力驗證則更多考慮本計劃的考察目的和范圍，樣品對于本能力驗證計劃而言“充分均勻”即可［4］。然而，在未能理解二者共同原理的情況下，能力驗證的簡化規(guī)定可能導(dǎo)致組織運作中對樣品均勻性的評價偏于簡單和表面化，出現(xiàn)能力驗證檢測方法選擇不當(dāng)，均勻性評價標(biāo)準(zhǔn)偏寬而能力評定標(biāo)準(zhǔn)差偏嚴(yán)等風(fēng)險［5］。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和能力驗證對樣品均勻性評價的要求比較

筆者以2019 年國家認(rèn)監(jiān)委A 類能力驗證計劃“雞蛋中氟蟲腈砜類成分的測定”運作為案例，報道了對所用檢驗方法進行驗證，對樣品的單元內(nèi)均勻性、單元間均勻性進行評價的工作。對樣品單元內(nèi)均勻性評價的原理和可用模型進行了分析和探討，展示了開展單元內(nèi)均勻性評價的作用，以及檢測方法的重復(fù)性對均勻性評價的影響，為相關(guān)能力驗證工作提供參考。

1 方法與過程

氟蟲腈砜是氟蟲腈在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中度毒性”的化合物。在2017 年歐洲“雞蛋氟蟲腈事件”后，我國也緊急制訂了針對雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法GB 23200.115–2018?；诒O(jiān)管需求，眾多檢測機構(gòu)已擴充了該方法資質(zhì)；此方法使用基質(zhì)分散固相萃取法前處理，液相色譜–質(zhì)譜外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，技術(shù)手段較為成熟，有必要且適合開展能力考察。

1.1 樣品制備

雞蛋粉樣品由專門養(yǎng)雞場獲取的陽性雞蛋制備而得，通過控制陰性與陽性雞蛋的投料比，制備雞蛋粉空白基質(zhì)和A，B，C 不同濃度組的陽性雞蛋粉樣品，作為考核樣和干擾樣。樣品制備過程見圖1。

圖1 雞蛋粉樣品制備流程圖

樣品為干燥的雞蛋粉，分裝成每瓶5～6 g 的規(guī)格。下文所述的瓶內(nèi)和單元間均勻性評價均以濃度A 樣品為對象。

1.2 實驗方法

本次能力驗證考核的方法為GB 23200.115–2018 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法》，樣品均勻性評價中也使用該方法檢測。

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g 試樣（精確至0.01 g）置于50 mL 離心管中，加入6.7 mL 水，超聲15 min，加入20 mL 乙腈，渦旋混勻1 min，振蕩提取5 min，加入2 g 氯化鈉和6 g 無水硫酸鈉，渦旋1 min，以5 000 r／min 離心5 min，上清液待凈化。

準(zhǔn)確吸取1.0 mL 上清液于含有50 mg PSA（N-丙基乙二胺）粉末、50 mg C18粉末和150 mg 無水硫酸鎂的2 mL 聚丙烯離心管中，渦旋混合30 s，以5 000 r／min 離心5 min，上清液過0.22 μm 濾膜，用于測定。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Atlanties T3–C18色譜柱（100 mm ×3.0 mm，3 μm，美國Water 公司）；流動相：A 相為乙酸銨（5 mmol／L）–甲酸（0.1%）混合溶液，B相為甲醇；流量：0.4 mL／min；進樣體積：2 μL；柱溫：35℃；梯度洗脫程序：0～2.0 min，60%B～70%B；2.0～2.5 min，70%B～98%B；2.5～5.5 min，98%B；5.5～6.0 min，98%B～60%B，后運行時間2 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

ESI–模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：250℃；干燥氣流量：7 L／min；霧化氣壓力：240 kPa；鞘氣溫度：325℃：鞘氣流量：11 L／min；噴嘴電壓：400 V；定性和定量離子列于表2。

表2 均勻性評價實驗的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察過程與結(jié)果

均勻性評價中使用了方差分析法，分析的主要對象是樣品檢測結(jié)果方差。方差代表了結(jié)果的離散性，因此受所用檢測方法重復(fù)性的影響。因此首先對方法的性能進行考察，主要包括加標(biāo)回收率和方法重復(fù)性考察。

將陰性雞蛋粉基質(zhì)置于錐形瓶中，充分振搖混勻后，稱取6 份1.000 0 g 子樣進行加標(biāo)，加標(biāo)水平與濃度A 樣品含量水平接近。加標(biāo)后按1.2 處理測定，計算回收率和重復(fù)性（RSD），結(jié)果見表3。由表3 可見，方法的回收率和重復(fù)性都在較好水平。

2.2 單元內(nèi)均勻性評價過程與結(jié)果

隨機抽取5 瓶樣品，每瓶平行稱取5 份1.000 0 g 子樣，按1.2.1 方法進行獨立平行測定，結(jié)果以樣品中氟蟲腈砜含量計，見表4。進行單因素方差分析，計算公式為F=MSwithin／MSmethod（式中：MSwithin使用表4 中MSwithin均值0.000 213 4，MSmethod見表3），計算得F=1.79。對應(yīng)自由度和顯著性水平下的臨界值Fcrit（0.05，20，5）=4.56，F(xiàn)

表3 回收率和重復(fù)性考察結(jié)果

表4 單元內(nèi)均勻性檢測結(jié)果與評價

2.3 單元間均勻性評價過程與結(jié)果

按CNAS GL 003 推薦方法，從濃度A 樣品中隨機抽取15 瓶樣品，每瓶平行稱取2 份1.0 g 子樣。按1.2.1 方法處理后，對得到的30 份待測液按隨機順序進樣檢測，對結(jié)果進行單因素方差分析，使用F值評價單元間均勻性，結(jié)果見表5 和表6。

表5 樣品單元間均勻性檢測結(jié)果

表6 樣品單元間均勻性檢測結(jié)果的方差分析

表6 中F 值小于臨界值Fcrit，代表組間方差與組內(nèi)方差相比不存在統(tǒng)計學(xué)差別，即單元間均勻性滿足要求。本計劃結(jié)束后，獲取的能力評定標(biāo)準(zhǔn)差為σ=0.027 8，使用SS ≤0.3σ 原則對單元間均勻性進行驗證［3］，確認(rèn)樣品的單元間均勻性滿足要求。

3 評價模型與討論

樣品的不均勻性是制備過程中形成的，是絕對概念，可以表述為異質(zhì)性；樣品均勻性是相對概念。開展均勻性評價，實質(zhì)是將樣品的異質(zhì)性量化，衡量其是否滿足統(tǒng)計規(guī)則的要求，得出樣品均勻或不均勻的結(jié)論。異質(zhì)性的量化有多種方式［6］，單因素方差分析是最常用的一種。均勻性評價可分為單元內(nèi)評價和單元間評價，能力驗證領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)文件對單元間評價給出了較明確描述，但未給出單元內(nèi)評價的模型或應(yīng)用舉例。

3.1 單元內(nèi)均勻性評價模型和分析

開展方差分析需要組內(nèi)方差和組間方差兩組數(shù)據(jù)，需明確方差的來源。在單元內(nèi)均勻性評價中，方差來源可參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制領(lǐng)域CNAS GL 017給出的模型，見圖2。

圖2 單元內(nèi)均勻性評價的組內(nèi)方差和組間方差來源模型

在此模型中，組間方差來源于不同子樣的測量方差，目的是反映物料異質(zhì)性；組內(nèi)方差來源于對一份子樣的多次測量，目的是反映所用檢測方法的重復(fù)性。然而在很多理化檢驗中，轉(zhuǎn)化指前處理，測量指儀器測試，二者是不同環(huán)節(jié)，鑒于樣品處理的復(fù)雜性和儀器性能的持續(xù)提升，前處理引入的重復(fù)性誤差遠大于儀器測試，很多研究也顯示來源于檢測器的不確定度只占很小比例［7］。如果對同一次轉(zhuǎn)化得到的待測液進行多次測量，得到的是檢測儀器的重復(fù)性精密度，而非檢測方法的重復(fù)性方差，因此不能作為組內(nèi)方差。缺乏合理的組內(nèi)方差成為開展單元內(nèi)均勻性評價單因素方差分析的難點。

為了解決這一問題，筆者尋找了組內(nèi)方差的其它來源。在方法學(xué)考察中，加標(biāo)試驗所用的n 份陰性樣品可視為含量均為0 的同一樣品，n 份陰性加標(biāo)試驗可視為對同一子樣進行的n 次轉(zhuǎn)化（n=6），因此，結(jié)果的方差（表3 中MSmethod）可以作為組內(nèi)方差。組間方差仍按圖2 中a 份子樣的方差執(zhí)行（a=5），為了提高穩(wěn)健性，取5 瓶樣品子樣MSwithin的均值（表4 中0.000 213 4），以此構(gòu)建單因素方差分析模型，完成單元內(nèi)的均勻性評價。雖然用加標(biāo)試驗的重復(fù)性估計方法重復(fù)性存在低估可能，但這一部分屬于組內(nèi)方差，在F 值計算中作為分母，因此得到F

3.2 方法重復(fù)性對均勻性評價的影響

在理想的單因素方差設(shè)計中，組間為待考察因素，組內(nèi)為待考察因素以外的其它因素［8］，但在實際應(yīng)用中，組間數(shù)據(jù)不能做到只包含待考察因素。圖3 展示了單因素方差分析的理論設(shè)計與實際情況的差別。箭頭左側(cè)為理論設(shè)計，箭頭右側(cè)為F 值計算公式所包含的實際因素。

圖3 單因素方差分析理論設(shè)計與實際情況的比較

在常用的單元間均勻性評價模型中，方差來源如圖4 所示，組間和組內(nèi)都包含重復(fù)平行檢測，因此MSbetween和MSwithin都受到了方法重復(fù)性MSmethod的影響。在各次測量中，方法重復(fù)性使測量結(jié)果偏大還是偏小具有隨機性，因此，雖然圖3 的分子和分母中都有方法重復(fù)性因素，但不能認(rèn)為方法重復(fù)性的影響可以抵消，也無法將MSmethod從MSbetween或MSwithin中扣除，只能使用MSbetween作為單元間異質(zhì)性的估計量?？梢悦鞔_的是，方法重復(fù)性越好，其影響就越小，越能得到準(zhǔn)確的均勻性評價結(jié)果。如果方法重復(fù)性方差與單元間異質(zhì)性方差相當(dāng)甚至更大，公式的結(jié)果將難以反映樣品異質(zhì)性，F(xiàn) 值向1 趨近，也可能得到F<1 的結(jié)果。ISO 13528 等文件指出了實際工作中會遇到F 值低于1 的情況［9］，但這一情況在實際中經(jīng)常不被理解和接受。

圖4 單元間均勻性評價的組內(nèi)方差和組間方差來源模型

對于單元內(nèi)均勻性評價來說，同樣存在用MSwithin估計單元內(nèi)異質(zhì)性的情況，不過這一估計僅存在公式的分子部分，比單元間均勻性評價的情況簡單，因此結(jié)論也更直接。

3.3 單元內(nèi)均勻性與單元間均勻性的關(guān)系

以粉末樣品的典型制備過程為例，原料經(jīng)過添加和均勻化，進行干燥、粉碎、過篩、制粒，物料的異質(zhì)性在這一階段形成。此后，物料再經(jīng)過混勻過篩，形成待分裝的物料堆。經(jīng)過分裝過程，帶有異質(zhì)性的物料被分配到每個包裝單元［10］，才被劃分為單元內(nèi)均勻性和單元間均勻性的概念，二者不是互相獨立的。以物料顆粒為觀察對象，分裝后的情況可以用圖5 示意，每根條柱代表一個物料顆粒，其長短代表特性量的異質(zhì)性，橢圓內(nèi)表示用于均勻性評價實驗的物料。單元內(nèi)的不均勻性主要是物料顆粒的異質(zhì)性，而單元間不均勻性除物料顆粒異質(zhì)性外，還包括分裝過程、包裝材料對物料作用等因素。

圖5 物料異質(zhì)性與單元內(nèi)不均勻性和單元間不均勻性關(guān)系示意圖

從本質(zhì)上來說，單元內(nèi)均勻性合格是單元間均勻合格的必要條件，但從評價結(jié)論上來說，單元間均勻性合格卻不是單元內(nèi)均勻性合格的充分條件，原因在于，圖3 公式中作為分子的單元間異質(zhì)性和作為分母的單元內(nèi)異質(zhì)性不是兩個獨立因素，此外還有方法重復(fù)性的因素，這些都影響了單元間均勻性評價的效力。因此，方法的重復(fù)性好是均勻性評價結(jié)論有效的前提，單元內(nèi)均勻性評價合格是單元間均勻性評價結(jié)論有效的前提。但在目前的能力驗證運作中，以單元間均勻性評價代表全部均勻性評價的做法比較普遍［2，11］，甚至在一些國家級標(biāo)物的研制中，也存在忽略方法性能研究，以單元間均勻性評價合格得出單元內(nèi)均勻性也合格的情況［12–14］，這些做法可能導(dǎo)致均勻性不足的樣品未被識別，最終影響預(yù)期用途。按照方法重復(fù)性考察>單元內(nèi)均勻性評價>單元間均勻性評價的順序開展，則可確保單元間均勻性合格的結(jié)論有效，也可輔助識別不均勻性的來源，比直接開展無交互作用的雙因素方差分析能獲取更多的信息［15］。

3.4 單元內(nèi)均勻性評價的其它方式

用于單元內(nèi)均勻性評價的樣品數(shù)量可參考ISO guide 35 給出的要求，當(dāng)抽取a 個單元，每單元取n 份子樣進行平行測定時，a 和n 應(yīng)滿足下列3 種條件之一：a=1 且n ≥6；a ≥3 且n=3；a ≥5 且n=2。表4 中，a=5，n=5，滿足要求，自由度為20；表5 中，a=15，n=2，也滿足要求，自由度為15。本次使用了自由度較大的表4 數(shù)據(jù)進行計算。在能力驗證中，開展單元間均勻性評價時，抽樣數(shù)量和平行測定次數(shù)滿足a ≥5 且n=2 的條件，這意味著單元間均勻性評價中的組內(nèi)均方也可作為單元內(nèi)均勻性評價的組間均方，這可作為一種節(jié)約工作量的方式。也有報道稱，增大實驗組數(shù)比提高每組的重復(fù)次數(shù)更有利于提升單因素方差分析的穩(wěn)健性［16］。

3.5 取樣的影響與應(yīng)對

圖3 中為了討論的便利，對于隨機因素只列出了方法重復(fù)性，實際上取樣過程也是一個重要的隨機因素，主要包括取樣的代表性和充足性。單元間取樣的代表性一般由隨機、系統(tǒng)隨機、分層隨機等方式控制，其充足性應(yīng)滿足標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的抽樣數(shù)量；單元內(nèi)取樣的代表性、充足性受物料異質(zhì)性和檢測取樣量的共同影響［17］。圖5 也展示了在一次檢測中取樣量的影響，瓶1 和瓶2 物料特性量的總和是相等的，但瓶2 的子樣1 和子樣2 的差別卻遠大于瓶1，加大取樣量和降低物料異質(zhì)性都可以避免這種情況，顯然加大取樣量更容易實現(xiàn)。因此，當(dāng)單元內(nèi)均勻性評價不能通過時，首先應(yīng)加大取樣量進行確認(rèn)，如果取樣量足夠大時仍不能通過，則有必要改進物料的制備工藝。

4 結(jié)語

報道了認(rèn)監(jiān)委A 類能力驗證項目“雞蛋中氰蟲腈類成分的測定”樣品的單元內(nèi)和單元間均勻性評價過程，給出了單元內(nèi)均勻性評價的一種可用模型。檢測方法的重復(fù)性對均勻性評價的影響不應(yīng)被忽視，有必要對其開展考察。單元間均勻性評價的單因素方差分析模型中，組內(nèi)和組間方差均為估計值，這使得單元間均勻性評價的結(jié)論不夠穩(wěn)健，建議同時開展單元內(nèi)均勻性評價。單元內(nèi)均勻性評價在評估能力驗證檢測方法、確認(rèn)最小取樣量、識別樣品不均勻性來源、增加單元間均勻性評價穩(wěn)健性等方面均能起到重要的作用。目前，能力驗證工作中對方法性能和單元內(nèi)均勻性評價的關(guān)注較少，對二者進行考察，有利于提高能力驗證的整體運作水平，可供能力驗證組織者參考。