超高效液相色譜法檢測(cè)土壤中硝基呋喃類藥物殘留

烏仁圖雅，鄧宇，榮迪，王巖，娜日娜，陳琪，趙劍平，正月

(內(nèi)蒙古赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古赤峰 024031)

硝基呋喃類抗生素是用于治療畜禽胃腸道疾病的藥物或飼料添加劑。硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物具有一定毒性，可致癌、致突變的作用［1–3］。因此美國(guó)于1993 年禁止將呋喃唑酮用作獸藥用于食品動(dòng)物，歐盟也于1995 年全面禁止使用呋喃唑酮類抗菌藥［4］，而我國(guó)農(nóng)業(yè)部193 號(hào)公告已明令禁止對(duì)食用動(dòng)物使用呋喃唑酮等硝基呋喃類藥物［5］。盡管如此，由于此類藥物高效廉價(jià)，有些不法商販仍在繼續(xù)使用。

我國(guó)是畜牧業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，畜牧業(yè)綜合生產(chǎn)能力位居世界前列。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)抗生素使用量約為9.7 萬噸［6］。許多用于畜禽生產(chǎn)的抗生素很難被動(dòng)物腸胃完全吸收，約30%～90%隨著糞便和尿液排出動(dòng)物體外［7］。因含有大量的有機(jī)質(zhì)、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，畜禽糞便常被作為有機(jī)肥用于生產(chǎn)糧食和蔬菜的農(nóng)田，從而使抗生素在農(nóng)田土壤、地表和地下水中不斷富集［8–9］，影響土壤中微生物種群、群落結(jié)構(gòu)、耐藥性等［10］。土壤中的抗生素通過根部進(jìn)入植物體內(nèi)，影響植物的根系發(fā)育、地上部分的生長(zhǎng)及抑制葉綠體合成酶的活性［11］。還會(huì)造成抗生素在植物體內(nèi)大量積累，通過食物鏈對(duì)動(dòng)物和人體產(chǎn)生毒害風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的 污染［7，12–13］。

目前，硝基呋喃類的檢測(cè)對(duì)象主要針對(duì)飼料、水體、動(dòng)物源性食品和蜂膠等，主要檢測(cè)方法有微生物法、免疫分析法、薄層分析法、高效液相色譜法、高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法等［14–20］。其中，高效液相色譜法具有效率高、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前采用最多的方法之一。筆者采用超高效液相色譜法建立了高效、快捷、準(zhǔn)確、靈敏的土壤中硝基呋喃類的檢測(cè)方法，并對(duì)樣品前處理進(jìn)行了優(yōu)化。該方法能夠完全實(shí)現(xiàn)土壤中硝基呋喃類藥物殘留量的檢測(cè)，準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定土壤中硝基呋喃類藥物殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：1290 型，配紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHY–A 型，金壇市成輝儀器廠；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ5200DE 型，昆山市超聲儀器有限公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：Multifuge X3R 型，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Rimedco 化學(xué)公司；

乙酸銨：分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；

呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)、呋喃唑酮(FZD)、呋喃它酮(FTD)標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于99.9%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 溶液配制

硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg／mL，稱取4種硝基呋喃類藥物各10 mg(精確到0.000 1 g)于4 只100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，超聲溶解，于4℃下可以保存6 個(gè)月。

硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液：10 μg／mL， 精密量取100 μg／mL 的4 種硝基呋喃類藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液各10 mL 于同一100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線。4℃下可以保存6 個(gè)月。

硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量10 μg／mL 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液于6 只10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，配制成硝基呋喃類藥物含量均分別為0.1，0.2，0.5，1，2，4 μg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品的采集和制備

土壤樣品于陰涼處風(fēng)干后，四分法分取2 kg 樣品，全部通過0.5 mm 樣品篩，放入自封袋中避光保存，備用。

1.4 樣品處理

稱取樣品(2±0.02) g 于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈–水（體積比為3∶2），振蕩5 min，在35℃條件下超聲提取15 min，離心10 min，重復(fù)提取3 次，上清液合并搖勻，置于50 mL 茄形瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用含0.1%甲酸的乙腈–水充分溶解復(fù)溶至10 mL，作為樣品溶液，待凈化。

將HLB 柱安裝與固相萃取裝置上，依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化。將上述樣品溶液通過固相萃取柱，用3 mL 水、3 mL 10%甲醇溶液淋洗、抽真空1 min，用甲醇洗脫，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加10%乙腈水2 mL 溶解殘余物，過0.2 μm 濾膜，供超高效液相色譜儀測(cè)定。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4.6 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；流量：1.0 mL／min；流動(dòng)相：A 為0.05% 乙酸銨溶液(pH 值為4.8)，B 為乙腈，A 與B 的體積比為80∶20，等度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

分別考察了磷酸、乙腈、水、甲醇、乙酸銨等單一或不同比例混合流動(dòng)相體系下色譜分離效果。結(jié)果顯示，流動(dòng)相體系為0.05%乙酸銨水溶液–乙腈(體積比例80∶20)，調(diào)節(jié)pH 值為4.8，等度洗脫條件下4 種化合物色譜峰的分離效果良好，峰形尖銳。色譜圖如圖1 所示。

圖1 4 種硝基呋喃類藥物的色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道從基質(zhì)中提取硝基呋喃類藥物殘留物通常使用乙酸乙酯［15–16］、乙腈［17–18］、甲醇和緩沖鹽［19–20］等。乙腈相對(duì)于甲醇有較低的吸光度和較強(qiáng)的脫洗能力，并且在相同的流量下不會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生多余的壓力。硝基呋喃類藥物的性質(zhì)各不相同，溶解性也各有差異。

試驗(yàn)考察了不同配比的乙腈水溶液對(duì)4 種硝基呋喃類藥物的提取效果。試驗(yàn)表明，不同配比的乙腈水提取溶液回收率不同，結(jié)果見圖2。

圖2 不同比例乙腈水提取液對(duì)回收率的影響

由圖2 分析得出，在乙腈–水的體積比為3∶2時(shí)，4 種硝基呋喃類藥物的回收率均較高，因此選擇乙腈–水的比例為3∶2。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響

當(dāng)提取溫度為45℃，提取次數(shù)為4 次時(shí)，設(shè)定超聲時(shí)間分別為2，5，10，15，20 min 進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響

由圖3 分析得出，在超聲時(shí)間為10 min 時(shí)，土壤中4 種硝基呋喃類藥物的回收率均較高。

2.3.2 提取溫度對(duì)回收率的影響

當(dāng)超聲時(shí)間10 min、提取次數(shù)4 次時(shí)，設(shè)定提取溫度分別為25，35，45，55，65℃，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，在提取溫度為45℃時(shí)，土壤中4 種硝基呋喃類藥物的回收率均較高。

2.3.3 提取次數(shù)對(duì)回收率的影響

當(dāng)超聲時(shí)間10 min、提取溫度為35℃時(shí)，設(shè)定提取次數(shù)分別為1，2，3，4，5 次，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖4 提取溫度對(duì)回收率的影響

圖5 提取次數(shù)對(duì)回收率的影響

由圖5 分析得出，在提取次數(shù)為4 次時(shí)，土壤中4 種硝基呋喃類藥物的回收率均較高。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間為5，10，15 min；提取溫度25，35，45℃；提取次數(shù)2，3，4 次，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。正交試驗(yàn)分析與結(jié)果見表2。

表1 正交設(shè)計(jì)表

表2 正交結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

通過極差分析得出，對(duì)回收率的影響主次順序?yàn)锽 ＞A ＞C，最優(yōu)組合為A3B2C3，即超聲時(shí)間為15 min，提取溫度為35℃，提取次數(shù)為4 次。

2.5 線性范圍和檢出限

按1.4 色譜條件測(cè)定1.2 配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以色譜峰面積(Y)對(duì)濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，硝基呋喃類藥物的質(zhì)量濃度在1～4 μg／mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。以不含目標(biāo)物的空白土壤樣品為基準(zhǔn)，添加硝基呋喃類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 方法處理，分別以3 倍和10 倍的信噪比計(jì)算出方法檢出限和定量限。土壤樣品中硝基呋喃類藥物的檢出限分別為NFZ 0.16 mg／kg，NFT 0.14 mg／kg，F(xiàn)ZD 0.16 mg／kg，F(xiàn)TD 0.12 mg／kg；定量限分別為NFZ 0.34 mg／kg，NFT 0.30 mg／kg，F(xiàn)ZD 0.34 mg／kg，F(xiàn)TD 0.27 mg／kg。

表3 線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

以不含目標(biāo)物的樣品為空白樣品，分別添加高、中、低3 個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 進(jìn)行處理，在1.5 色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。土壤空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖見圖6。由表4 可知，4 種硝基呋喃類藥物的回收率為74.34%～102.52%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%～4.49%(n=6)，說明該方法具有良好的精密度與準(zhǔn)確度。

表4 方法的精密度和回收率(n=6)

3 結(jié)語

圖6 空白樣品(A)和20.0 mg／kg 加標(biāo)樣品(B)的色譜圖

對(duì)土壤樣品中硝基呋喃類藥物的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用超高效液相色譜法測(cè)定土壤中硝基呋喃類藥物。該方法操作簡(jiǎn)單可靠、快速，可用于農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為進(jìn)一步制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)提供參考。