利用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)大熊貓陰道菌群的研究

李才武， 張 蘭， 張志忠,3， 張貴權(quán)， 魏榮平， 吳代福， 瞿春茂，李 鳳， 金森燕， 董 超， 程建斌， 楊長(zhǎng)江， 何勝山， 劉小強(qiáng)， 黃 炎

(1.大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心)邛崍山瀕危野生動(dòng)植物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家長(zhǎng)期科研基地, 都江堰 611830；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610065；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物保護(hù)司, 北京 100714； 4.四川臥龍自然保護(hù)區(qū)管理局, 臥龍 623006)

1 引 言

大熊貓是我國(guó)國(guó)寶級(jí)動(dòng)物,其繁殖率較低，是易危動(dòng)物之一[1].因此，在人工飼養(yǎng)環(huán)境下，提高大熊貓繁殖率十分重要.有研究報(bào)道顯示，某些生殖道微生物可直接或間接影響動(dòng)物繁殖率[2].另外，對(duì)人和動(dòng)物的陰道微生態(tài)的研究表明，陰道微生態(tài)的失衡及微生物感染與不孕存在密切關(guān)系[3]，如人類的外陰陰道炎[4]、宮頸炎[5]、奶牛的臨床陰道炎[6]等.近年來(lái)，已有對(duì)豬[7-8]、牛[9]、馬[10]等動(dòng)物的陰道菌群的研究報(bào)道，除此之外，對(duì)大熊貓生殖道微生物菌群也開(kāi)展了研究.本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中利用微生物分離鑒定及高通量測(cè)序[11]揭示了正常大熊貓的陰道和子宮的細(xì)菌微生物組以及大熊貓陰道真菌微生物的多樣性與豐度[12-13]，但是使用細(xì)菌分離培養(yǎng)方法能培養(yǎng)出的細(xì)菌非常有限，而高通量測(cè)序方法僅能針調(diào)查部分細(xì)菌和真菌，不能了解其他微生物的組成情況.所以利用這兩個(gè)方法不能夠全面的反映大熊貓生殖道中的微生物菌群[14].

宏基因組測(cè)序技術(shù)能對(duì)樣本中所有的微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性等進(jìn)行全面分析.在本研究中，我們采用宏基因組測(cè)序方法對(duì)生活在不同地區(qū)、不同年齡的大熊貓陰道樣本進(jìn)行了微生物全面分析，有助于大熊貓生殖道感染性疾病的防治，為科學(xué)的保護(hù)、繁育大熊貓?zhí)峁?shù)據(jù)支持.

2 材料和方法

2.1 材 料

2018年，根據(jù)大熊貓生活的不同區(qū)域和年齡，采集14個(gè)大熊貓陰道樣本.

2.2 方 法

2.2.1 樣本采集方法 使用長(zhǎng)無(wú)菌拭子采集妊娠期的大熊貓生殖道(陰道)分泌物[12]，然后將每個(gè)拭子置于無(wú)菌的5 mL螺旋蓋管中，運(yùn)送樣品至四川省動(dòng)物疫病防控與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冷凍保存，直至提取DNA時(shí)取出.

根據(jù)生活地區(qū)和年齡分為兩個(gè)大組：地區(qū)組(WLQ、BFX、DJY)和年齡組(A1、A2、A3).如表1 所示.根據(jù)不同的年齡將這14個(gè)樣品分為3組：其中5～10歲的為A1組(SZD1、SZD2、SZD3、SZD4、SZD5、SZD6、SZD7)；11～16歲的為A2組(SZD8、SZD9、SZD10、SZD11、SZD12)；17～23歲的為A3組(SZD13、SZD14).根據(jù)不同的采樣點(diǎn)將其分成三組.將來(lái)自臥龍的5個(gè)陰道樣品分成WLQ組(SZD1、SZD2、SZD8、SZD13、SZD14)，將來(lái)自雅安碧峰峽的6個(gè)陰道樣本分成BFX組(SZD4、SZD5、SZD9、 SZD10 、SZD11、 SZD12).同時(shí)將來(lái)自都江堰的3個(gè)陰道樣本分成DJY組(SZD3、SZD6、SZD7).

表1 14個(gè)大熊貓陰道樣品分組信息

2.2.2 樣品DNA提取 將拭子從冰箱中拿出來(lái)，放在冰上解凍.待解凍完全后，每個(gè)樣品加入2 mL的PBS磷酸緩沖液，然后將拭子渦旋震蕩.隨后使用康為世紀(jì)生物科技有限公司的DNA提取試劑盒提取樣本全基因組DNA，提取方法按照試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明書(shū)執(zhí)行.使用1%瓊脂糖凝膠電泳(AGE)分析 DNA 的純度和完整性，同時(shí)使用Qubit 對(duì) DNA 濃度進(jìn)行精確定量.

2.2.3 宏基因組測(cè)序及分析 將合格的DNA樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序，分析樣品中含有的各種微生物的相對(duì)豐度、功能基因和抗性基因.組裝的基因組或重疊群序列主要使用的是MetaGeneMark、CD-HIT、Bowtie2軟件進(jìn)行的分析.物種注釋主要使用genes 與各功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì):DIAMOND軟件將 Unigenes 與從 NCBI 的 NR(Version: 2018.01) 數(shù)據(jù)庫(kù)中抽提出的細(xì)菌(Bacteria)、真菌(Fungi)、古菌(Archaea)和病毒(Viruses)序列進(jìn)行比對(duì)(blastp，evalue ≤ 1e-5).功能注釋主要使用DIAMOND軟件將 Unigenes 與各功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(blastp，evalue ≤ 1e-5).抗性基因注釋主要使用CARD數(shù)據(jù)庫(kù)(v2.0.1)提供的Resistance Gene Identifier (RGI)軟件將 Unigenes 與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(RGI內(nèi)置blastp，采用bitscore值對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分).

技術(shù)參數(shù)是利用Illumina技術(shù)測(cè)序平臺(tái)和雙末端測(cè)序(Paired-End)，建立的文庫(kù)類型為350b小片段文庫(kù)，測(cè)序策略是Illumina PE150，每個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)量(raw data)為6G.

3 結(jié) 果

3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)概述

本研究采用 Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，共獲得 94 662.28 Mbp 的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)(平均數(shù)據(jù)量為 6 761.59 Mbp)，經(jīng)過(guò)質(zhì)控得到 94 455.81 Mbp 的有效數(shù)據(jù)(Clean Data)(平均數(shù)據(jù)量為 6 746.84 Mbp)，經(jīng)過(guò)單樣品組裝及混合組裝后，共得到 477 921 089 bp 的 Scaftigs.對(duì)各樣品及混合組裝的結(jié)果，采用 MetaGeneMark 軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，共得到 583 524 個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)(平均為 38 902)，經(jīng)過(guò)去冗余后，共獲得 412 312 個(gè)ORFs，總長(zhǎng)為 233.7 Mbp，其中完整基因的個(gè)數(shù)為 74 805，所占比例為 18.14%.非冗余基因集與 MicroNR 庫(kù)進(jìn)行 blastp 比對(duì)，運(yùn)用 LCA 算法進(jìn)行物種注釋，注釋到屬和門的比例分別為 84.21% , 96.43%.使用 DIAMOND 軟件對(duì)非冗余基因集進(jìn)行常用功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋(e-value ≤10～5)，有 9 978(2.42%) 個(gè) ORFs 比對(duì)到 CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)，259 596(62.96%) 個(gè) ORFs 比對(duì)到 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，240 050(58.22%) 個(gè) ORFs 比對(duì)到 eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù).非冗余基因集與抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)(CARD)進(jìn)行注釋(e-value ≤10～30)，有299 個(gè)基因比對(duì)到 CARD 數(shù)據(jù)庫(kù).

3.1.1 測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理 采用 Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)存在一定比例低質(zhì)量數(shù)據(jù)，為了保證后續(xù)分析的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，需要對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，獲取用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Clean Data).具體處理步驟如下：

1) 去除所含低質(zhì)量堿基(質(zhì)量值≤38)超過(guò)一定比例(默認(rèn)設(shè)為 40 bp)的 reads；

2) 去除 N 堿基達(dá)到一定比例的 reads(默認(rèn)設(shè)為10 bp)；

3) 去除與 Adapter 之間 overlap 超過(guò)一定閾值(默認(rèn)設(shè)為 15 bp)的 reads；

4) 如果樣品存在宿主污染，需與宿主序列進(jìn)行比對(duì)，過(guò)濾掉可能來(lái)源于宿主(默認(rèn)采用 Bowtie2 軟件，參數(shù)設(shè)置: --end-to-end, --sensitive, -I 200, -X 400)的 reads；

測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2.

3.1.2 Metagenome組裝 使用SOAP denovo組裝軟件進(jìn)行組裝分析，具體組裝步驟如下：

1) 經(jīng)過(guò)預(yù)處理后得到 Clean Data，使用 SOAP denovo 組裝軟件進(jìn)行組裝分析(Assembly Analysis)；

2) 對(duì)于單個(gè)樣品，組裝時(shí)選取 K-mer=55進(jìn)行組裝，得到該樣品的組裝結(jié)果；組裝參數(shù)：-d 1, -M 3, -R, -u, -F；

3) 將組裝得到的 Scaffolds 從 N 連接處打斷，得到不含 N 的序列片段，稱為 Scaftigs (i.e., continuous sequences within scaffolds)；

4) 將各樣品質(zhì)控后的 CleanData 采用 Bowtie2 軟件比對(duì)至各樣品組裝后的 Scaftigs 上，獲取未被利用上的 PE reads：比對(duì)參數(shù)：--end-to-end, --sensitive, -I 200, -X 400；

5) 將各樣品未被利用上的 reads 放在一起，選取 K-mer=55進(jìn)行混合組裝，其他組裝參數(shù)與單樣品組裝參數(shù)相同；

6) 將混合組裝的 Scaffolds 從 N 連接處打斷，得到不含 N 的 Scaftigs 序列；

7) 對(duì)于單樣品和混合組裝生成的 Scaftigs，過(guò)濾掉 500 bp以下的片段，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和后續(xù)的分析(表3).

表2 14個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

表3 各樣品組裝結(jié)果Scaftigs 基本信息統(tǒng)計(jì)(>=500 bp)

3.2 物種注釋

3.2.1 樣品的相對(duì)豐度分析 各組以及各樣品中微生物在門水平上最大相對(duì)豐度排名前10的物種分別見(jiàn)表4、5、6.如表所示，在這些樣品中占主導(dǎo)地位的門主要為變形菌門(Proteobacteria), 擔(dān)子菌門(Basidiomyta), 厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria),分別占樣品的平均值為34.75%、21.53%、5.52%和3.29%.同時(shí)在屬的水平上分析，其結(jié)果為：以假單胞菌(21.90%)最多，其次為鏈球菌(3.47%)、冷桿菌(1.89%)和變形桿菌(1.38%).從表3、4中可以看出，不同的分組，其優(yōu)勢(shì)菌門不同(將物種相對(duì)豐度大于1%的規(guī)定為優(yōu)勢(shì)門)，在WLQ組中優(yōu)勢(shì)門為變形菌門和厚壁菌門；在BFX組中的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門、擔(dān)子菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門；在DJY組中的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和衣原體.在A1組中的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門；在A2組中的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門、擔(dān)子菌門、厚壁菌門和放線菌門；在A3組中的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門和厚壁菌門.擔(dān)子菌門只在BFX組和A2組中為優(yōu)勢(shì)菌門，衣原體在DJY組豐度較高.

表4 在門水平上14個(gè)樣品的物種相對(duì)豐度表

表5 在門水平上WLQ、BFX、DJY這個(gè)三個(gè)組的物種相對(duì)豐度表

表6 在門水平上AGE1、AGE2、AGE3這三個(gè)組的物種相對(duì)豐度表

3.2.2 基于物種豐度的聚類分析 為了進(jìn)一步的研究不同樣品的相似性，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樣品的聚類樹(shù).采用Bray-Curtis 距離系統(tǒng)聚類法，從基因在各樣品中的豐度出發(fā)，以Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)行樣品間聚類分析，并將聚類結(jié)果與各樣品在屬水平上的物種相對(duì)豐度整合進(jìn)行展示.(如圖1所示)結(jié)果顯示：總體上，WLQ、DJY、和BFX這三個(gè)地區(qū)組和A1、A2和A3這三個(gè)年齡組都可以單獨(dú)聚類，但在年齡組方面的聚類更加明顯.說(shuō)明生活地區(qū)和年齡的差異對(duì)大熊貓陰道的微生物菌群都有一定的影響，但年齡對(duì)大熊貓陰道菌群的影響更加明顯.

圖1 在屬水平上基于 Bray-Curtis 距離的聚類樹(shù)

A圖代表不同地區(qū)差異(WLQ組、BFX組、DJY組)的基于 Bray-Curtis 距離的聚類樹(shù).B圖代表不同年齡差異(A1組、A2組、A3組)的基于 Bray-Curtis 距離的聚類樹(shù).圖中，左側(cè)是 Bray-Curtis 距離聚類樹(shù)結(jié)構(gòu)；右側(cè)的是各樣品在屬水平上的物種相對(duì)豐度分布圖.

Fig.1 Clustering tree based on Bray-Curtis distance at genus level

圖2 在基因功能水平上基于Bray-Curtis距離的聚類樹(shù)

A圖代表不同地區(qū)差異(WLQ組、BFX組、DJY組)的基于 Bray-Curtis 距離的聚類樹(shù)，B圖代表不同年齡差異(A1組、A2組、A3組)的基于 Bray-Curtis 距離的聚類樹(shù).圖中，左側(cè)是 Bray-Curtis 距離聚類樹(shù)結(jié)構(gòu)；右側(cè)的是各樣品在門水平上的物種相對(duì)豐度分布圖.

Fig.2 Clustering tree based on bray-curtis distance at gene function level

3.3 功能注釋

功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果概述：原始去冗余后的預(yù)測(cè)基因共有 412 312個(gè)，有259 596(62.96%)個(gè)基因能夠比對(duì)上 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，有143 757(34.87%) 個(gè)基因能夠比對(duì)上數(shù)據(jù)庫(kù)中的 7 791個(gè) KEGG ortholog group(KO)；有240 050(58.22%)個(gè)基因能夠比對(duì)上 eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)；有 9 978(2.42%) 個(gè)基因能夠比對(duì)上 CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù).

3.3.1 樣品的聚類分析 根據(jù)Unigenes在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)六大代謝通量中的注釋情況并基于Bary-Curtis距離繪制了聚類樹(shù)(圖2A、B).從圖中可以看出樣品在基因功能上的Bary-Curtis距離與在物種上的Bary-Curtis距離相似，結(jié)果一致：相比于按地區(qū)分組來(lái)說(shuō)，按照年齡分組的樣品更能體現(xiàn)各組間的功能差異.表明年齡的差異對(duì)大熊貓陰道菌群的影響較大.

3.3.2 基于功能豐度的降維分析 為研究地區(qū)組和年齡組中功能組成的相似度，在KEGG水平上對(duì)功能豐度值進(jìn)行了PCA分析.如圖3所示，在地區(qū)組中，WLQ組和DJY組的功能具有一定的相似性，BFX組則與WLQ組和DJY組存在一定的差異性.在年齡組中，A1組中的樣品在功能上存在一定的相似性，而A2組和A3組中的樣品功能差異較明顯.總的來(lái)說(shuō)，盡管個(gè)體間差異較明顯，但每一個(gè)組都表現(xiàn)為獨(dú)立的分布.

PCA結(jié)果展示，橫坐標(biāo)表示第一主成分，百分比則表示第一主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值；縱坐標(biāo)表示第二主成分，百分比表示第二主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值；圖中的每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，同一個(gè)組的樣品使用同一種顏色表示.A圖代表不同地區(qū)差異(WLQ組、BFX組、DJY組)的PCA 分析，B圖代表不同年齡差異(A1組、A2組、A3組)的PCA 分析.

Fig.3 PCA analysis based on functional abundance

A、B、C圖按照地區(qū)分組的分別為WLQ組、BFX組和DJY組中的抗性基因物種歸屬分析圈圖.圈圖中的內(nèi)圈為ARO 的物種分布情況，外圈為組內(nèi)所有樣品基因的物種分布情況.

Fig.4 Resistance gene species assignment analysis circle map and resistance mechanism and species Overview circle diagram

3.4 抗性基因注釋

3.4.1 抗性基因的物種歸屬關(guān)系 根據(jù)樣品的基因物種注釋結(jié)果，可以分析各耐藥基因所對(duì)應(yīng)的物種信息，通過(guò)比較耐藥基因所屬的物種信息可以直觀的反映攜帶耐藥基因的優(yōu)勢(shì)菌群.如圖4所示，在WLQ組中(圖4A)，變形菌門、厚壁菌門為占主導(dǎo)地位的兩個(gè)菌種，分別占菌量的30%、6%，而各自攜帶的耐藥基因比例分別為62%、4%；在BFX組中(圖4B)，變形菌門、擔(dān)子菌門，放線菌門為占主導(dǎo)地位的三個(gè)菌種，分別占菌量的58%、6%、4%，而各自攜帶的耐藥基因比例分別為40%、12%、4%；在DJY組中(圖4C)，變形菌門，擬桿菌門為占主導(dǎo)地位的兩個(gè)菌種，分別占菌量的16%、5%，而各自攜帶的耐藥基因比例分別為63%、3%.這種不對(duì)稱的結(jié)果表明，變形菌門比厚壁菌門和擬桿菌門更易攜帶耐藥基因，但各組中占主導(dǎo)地位的菌種與在物種注釋中各組的優(yōu)勢(shì)菌門結(jié)果一致.

圖5 ARO分布情況熱圖Fig.5 ARO distribution heat map注：橫軸為樣品名稱，右側(cè)縱軸為抗性基因類型 ARO 名稱，黑色表示樣品中含有該 ARO，白色表示樣品中沒(méi)有該 ARO.

3.4.2 抗性基因類型的分布 為了反映各抗性基因類型(ARO)在各樣品中的分布情況，繪制ARO分布的黑白熱圖(圖5)，從圖中可以看出，沙門氏菌耐藥基因APH3-lb分布最廣，存在于所有的14個(gè)樣品中.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)耐藥基因mexQ只存在樣品SZD2中，耐藥基因vanWl只存在樣品SZD4中.而與之相反的是，耐藥基因APH6-ld、AAC6-lla、Sul1分別廣泛存在于除了樣品SZD6、SZD1、SZD3的其他樣品中.

4 討 論

4.1 樣品的物種注釋

宿主中微生物種群數(shù)量的不同會(huì)對(duì)宿主造成不同的影響.比如高豐度的厚壁菌門或者低豐度的擬桿菌門會(huì)對(duì)宿主的肥胖有一定的影響[15].同時(shí)微生物多樣性的變化從側(cè)面反映了機(jī)體的正常情況.患者腸道中的微生物多樣性會(huì)出現(xiàn)顯著的降低，并且厚壁菌門和梭菌屬所占的比例也顯著降低[16].

在我們所研究樣本中，占主導(dǎo)地位的門主要為變形菌門、擔(dān)子菌門、厚壁菌門和放線菌門.這與前人關(guān)于正常大熊貓生殖道菌群的結(jié)果一致.但檢測(cè)出來(lái)衣原體，并且衣原體感染可以影響生物的繁殖能力[17].因此推測(cè)衣原體可能對(duì)大熊貓的繁殖能力具有潛在的不利影響.在物種樣品聚類分析的這一方面發(fā)現(xiàn)生活地區(qū)和年齡的差異對(duì)大熊貓陰道的微生物菌群都有一定的影響，但年齡的差異對(duì)大熊貓陰道菌群的影響更加明顯.

4.2 樣品的功能注釋

從分類和功能組成的角度來(lái)看，腸道微生物群可能與許多復(fù)雜的疾病有關(guān).有研究發(fā)現(xiàn)泌乳期奶牛中瘤胃微生物群會(huì)隨年齡和生理狀態(tài)的變化而變化，并且通過(guò)對(duì)其進(jìn)行宏基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)其基因序列對(duì)碳水化合物，蛋白質(zhì)代謝等近50%的代謝具有潛在貢獻(xiàn)[18].

同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)大熊貓生殖道的基因除了未被注釋的功能序列之外，主要功能是新陳代謝，其次是環(huán)境信息處理.這與其他有關(guān)微生物菌群宏基因組的研究結(jié)果一致[19].說(shuō)明大多數(shù)生物中的基因主要表現(xiàn)為新陳代謝這一功能，維持生物的正常生命活動(dòng).此外，根據(jù)物種和功能豐度的聚類分析可以得出：樣品按照年齡分組進(jìn)行的聚類分析能更加的明顯的看出各組之間的不同，因此與地區(qū)差異相比，年齡差異對(duì)大熊貓生殖道中微生物菌群的物種和功能豐度的影響較大.這與在物種注釋中關(guān)于樣品聚類分析得到的結(jié)果一致.

4.3 樣品的抗性基因注釋

抗生素能夠在防治動(dòng)物疾病方面發(fā)揮重要作用，然而最近幾年抗生素的濫用導(dǎo)致許多動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了具有抗生素耐藥性的細(xì)菌，比如在綿羊瘤胃中發(fā)現(xiàn)了達(dá)托霉素和粘菌素[20].同時(shí)在豬、雞和人類的糞便中也發(fā)現(xiàn)了高水平的四環(huán)素和紅霉素等[21].

在抗性基因的注釋中，雖然并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特別的耐藥基因，但我們發(fā)現(xiàn)耐藥基因所屬物種的優(yōu)勢(shì)菌門與樣品在物種注釋中所呈現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌門一致，均為變形菌門、厚壁菌門、擔(dān)子菌門和放線菌門.并且變形菌門比厚壁菌門和擬桿菌門更易攜帶耐藥基因.從抗性基因數(shù)目來(lái)看，地區(qū)組和年齡組中含量最多的為BFX組和A2組，并且由于BFX組中的樣品年齡均在A2組的范圍中，因此推測(cè)年齡的差異對(duì)各樣品中抗性基因的數(shù)目有較大的影響.