仙茅化學(xué)成分的研究

陳 麗， 康 敏， 鄧小寬， 吳 眾， 曾邦國， 高 平

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065;2. 成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，成都 610041； 3. 四川國強(qiáng)中藥飲片有限公司，成都 610200)

1 引 言

仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)是一種具有長圓柱形根狀莖的小型草本植物[1]，又名地棕、獨(dú)茅、山黨參、海南參、婆羅門參，主產(chǎn)于四川、貴州、云南、廣西等地[2]，以其“壯陽活性”而聞名[3]. 有研究表明仙茅提取物還具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗骨質(zhì)疏松[6]、抗氧化作用[7]、抑菌[8]、神經(jīng)保護(hù)[3]、防止順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[9]等作用. 因此，該植物具有極大的藥用價(jià)值，但目前多數(shù)藥理活性研究還基本處于仙茅的粗提物層面，其作用機(jī)制及其具體作用成分還有待于進(jìn)一步深入研究.

目前就仙茅化學(xué)成分的研究可知，仙茅富含多糖、皂苷、酚類、酚苷、萜類等化合物[6]，其中僅酚苷類物質(zhì)“仙茅苷”被納入《中國藥典》作為藥材的質(zhì)量控制指標(biāo). 然而，汪瀅等[10]在測定仙茅中多種酚苷類成分時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地仙茅藥材中酚苷類成分的含量差異較大，以苔黑酚類化合物的含量最高，其次為仙茅苷. 相關(guān)研究說明用單一指標(biāo)來評價(jià)藥材的質(zhì)量存在明顯缺陷，研究尋找仙茅中更多的其它相關(guān)成分，進(jìn)一步為仙茅建立多成分質(zhì)量控制方法是必須的，也是極為重要的.

為了進(jìn)一步明確仙茅中的化學(xué)成分，以期為今后仙茅的活性篩選、指紋圖譜以及質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ). 本實(shí)驗(yàn)對仙茅甲醇提取物的正丁醇萃取部位進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離鑒定了 10個(gè)化合物，分別為2, 6-二甲氧基苯甲酸(1)、咖啡酸(2)、原兒茶酸(3)、orchioside B (4)、curculigoside C(5)、orchioside E(6)、丁香酸(7)、hemsleyanumoide(8)、丁香酸葡萄糖苷(9)、綠原酸(10).

2 材料與方法

2.1 材 料

干燥仙茅根莖由四川國強(qiáng)中藥飲片有限公司鑒定并提供. 所用試劑均為分析純或色譜純(成都科龍化工試劑廠). 高速中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司，150搖擺式)；LC3000高效液相色譜儀(UV3000紫外檢測器，P3000高壓輸液泵，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，色譜柱InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，Sepax Sapphire)；C18柱(YMC-C18-10 μm)；制備儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；柱色譜用硅膠 200-300目(成都科龍化工試劑廠)；玻璃層析柱(直徑10 cm，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；MicrOTOF QⅡ(德國Bruker公司)；Bruker Avance Ⅱ-400 MHz 和 Bruker Avance Ⅱ-600 MHz spectrometer(德國Bruker公司).

圖1 仙茅甲醇提取物正丁醇部位的分離流程圖

2.2 方 法

2.2.1 提 取 取干燥的仙茅根莖6 kg粉碎，用40 L甲醇進(jìn)行滲漉提取，提取液經(jīng)55 ℃旋蒸濃縮至無醇味，加少量水混懸后，用正丁醇連續(xù)萃取3次，合并萃取液并減壓干燥，得到仙茅正丁醇萃取物.

2.2.2 分離純化 采用1 kg硅膠進(jìn)行濕法裝柱(石油醚)，正丁醇萃取物經(jīng)甲醇溶解，加入0.5 kg硅膠混勻拌干后進(jìn)行干法上樣. 分別用乙酸乙酯/石油醚(1/1)、乙酸乙酯以及乙酸乙酯/甲醇(100/1、50/1、20/1、10/1、5/1)梯度洗脫. 經(jīng)HPLC檢測合并相似流份，得到4個(gè)組分(Fr. A-D). Fr. A進(jìn)一步經(jīng)C18中壓色譜柱，20%-40%甲醇梯度洗脫，得到含有化合物1、2、3、7四個(gè)成分含量較多的兩個(gè)粗分段Fr. A-1和Fr. A-2；每個(gè)分段經(jīng)過高壓制備色譜，均以10%～20%乙腈水的梯度進(jìn)行細(xì)分離，經(jīng)過幾次重復(fù)柱層析，得到上述4個(gè)單體. Fr. B經(jīng)各種柱層析未能得到高純度化合物. Fr. C經(jīng)C18中壓色譜柱，20%～40%甲醇梯度洗脫，得到Fr. C-1～3，其中Fr. C-3經(jīng)高壓色譜系統(tǒng)，15%～20%乙腈水洗脫，重復(fù)高壓制備層析兩次，得到純度高的化合物4. Fr. C-2段經(jīng)10%～15%乙腈水多次高壓制備色譜系統(tǒng)層析，得到純的化合物5、6. Fr. D經(jīng)C18中壓色譜柱，20%～40%甲醇梯度洗脫，得到組分Fr. D-1、Fr. D-2. 其中Fr. D-1與Fr. C-1經(jīng)5%乙腈水洗脫過后的殘余浸膏合并，再經(jīng)10%乙腈水多次高壓制備色譜系統(tǒng)層析，得到化合物8、9、10.

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針晶.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.73 (s, 1H, COOH), 7.31 (t, J = 8.4 Hz, 1H, H-4), 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-3, H-5), 3.75 (s, 6H, OMe-2, OMe-6);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.19 (s, COOH), 156.57 (s, C-2, C-6), 130.90 (s, C-4), 114.78 (s, C-1), 104.58 (s, C-3,C-5), 56.21 (s, OMe-2, OMe-6). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]，故化合物1鑒定為2,6-二甲氧基苯甲酸，其分子式為C9H10O4.

化合物2：白色片狀結(jié)晶.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.13 (s, 1H，COOH), 9.54 (s, 1H, OH), 9.15 (s, 1H，OH), 7.42 (m, 1H, H-7), 6.97 (m, 2H，H-2, H-6), 6.77 (t, J = 16.9 Hz, 1H, H-5), 6.18 (d, J = 15.9 Hz, 1H, H-8);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 168.38 (s, COOH), 148.59 (s, C-7), 146.01 (s, C-4), 145.06 (s, C-3), 126.15 (s, C-1), 121.62 (s, C-8), 116.20 (s, C-2), 115.56 (s, C-5), 115.08 (s, C-6). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物2為咖啡酸，分子式為C9H8O4，并且首次在仙茅植物中得到.

化合物3：無色針晶.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.33 (s, 1H, COOH), 9.68 (s, 1H, OH), 9.31 (s, 1H, OH), 7.46 - 7.21 (m, 2H, H-2, H-6), 6.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-5);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.77 (s, C-7), 150.46 (s, C-4), 145.33 (s, C-3), 122.36 (s, C-6), 122.09 (s, C-1), 116.99 (s, C-2), 115.61 (s, C-5). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物3物質(zhì)為原兒茶酸，分子式為C7H6O4.

化合物4：白色固體. ESI-MS at m/z 460.87 [M - H]-.1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.85 (m, 2H, H-2'', H-6''), 6.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-2'), 6.82 (m, 3H, H-3'', H-5'', H-5'), 6.75 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-6'), 4.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-1'''), 4.57 (d, J = 6.0 Hz, 1H, H-1), 4.50 (s, 1H, H-2), 3.86 (dd, J = 12.0, 2.2 Hz, 1H, H-6'''), 3.69 (dd, J = 12.0, 5.6 Hz, 1H, H-6'''), 3.62 (dd, J = 9.3, 8.7 Hz, 1H, H-2'''), 3.50 (t, J = 9.0 Hz, 1H, H-3'''), 3.39 (m, 1H, H-5'''), 3.31 (m, 1H, H-4'''), 3.11 (ddd, J = 17.3, 8.8, 5.3 Hz, 1H, H-4), 3.02 (ddd, J = 17.3, 8.5, 6.8 Hz, 1H, H-4), 2.05 (m, 1H, H-3), 1.81 (m, 1H, H-3);13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 199.30 (s, C-5), 162.34 (s, C-4''), 145.13 (d, C-3'), 144.96 (d, C-4'), 130.48 (s, C-1'), 130.36 (s, C-2'', C-6''), 128.60 (s, C-1''), 119.34 (s, C-6'), 114.81 (d, C-2', C-5'),114.76 (d, C-3'', C-5''), 96.03 (s, C-1'''), 78.54 (s, C-5'''), 78.10 (s, C-1), 74.60 (s, C-3'''), 74.21 (s, C-2), 72.43 (s, C-2'''), 70.51 (s, C-4'''), 61.15 (s, C-6'''), 33.24 (s, C-4), 26.07 (s, C-3). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故化合物4物質(zhì)為orchioside B，分子式為C23H26O10.

化合物5：白色固體. ESI-MS at m/z: 504.78 [M+Na]+.1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-3), 6.92 (d, J = 3.0 Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H, H-4'), 6.71 (dd, J = 8.8, 3.0 Hz, 1H, H-5'), 6.65 (d, J = 8.9 Hz, 1H, H-4), 5.44 (dd, J = 30.2, 13.0 Hz, 2H, H-7), 4.77 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-1''), 3.75 (d, J = 10.8 Hz, 6H, H-2', H-6', OCH3), 3.70 (dd, J = 12.0, 5.3 Hz, 1H, H-6''a), 3.42 (ddd, J = 36.8, 15.6, 8.0 Hz, 4H, H-2'', H-3'', H-5'', H-6''b) , 3.31 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz, 1H, H-4'');13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 166.69(s, C-7'), 152.54(s, C-5), 149.71 (s, C-2), 148.45(s, C-6'), 145.15 (s, C-2'), 143.84 (s, C-3')，127.15(s, C-1), 118.77(s, C-1'), 117.56 (s, C-3, C-4'), 115.29 (s, C-4), 115.09 (s, C-6), 107.26 (s, C-5'), 102.87 (s, C-1''), 76.72 (d, C-3''), 76.65 (d, C-5''),73.62 (s, C-2''), 70.01 (s, C-4''), 61.99 (s, C-7), 61.21 (s, C-6''), 60.42 (s, C-2'-OMe), 55.63 (s, C-6'-OMe). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[11]，故鑒定化合物5物質(zhì)為curculigoside C，分子式為C22H26O12.

化合物6：白色固體. HR-ESI-MS at m/z 461.08 [M - H]-.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-2'', H-6''), 6.81 (m, 3H, H-2', H-3'', H-5''), 6.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-5'), 6.60 (dd, J = 8.1, 1.3 Hz, 1H, H-6'), 4.67 (s, 1H, H-1'''), 4.49 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 4.08 (dt, J = 11.3, 3.4 Hz, 1H, H-2), 3.70 (d, J = 11.2 Hz, 2H, H-6'''), 3.30 (m, 2H, H-2''', H-3'''), 3.16 (m, 1H, H-5'''), 3.03 (m, 1H, H-4'''), 2.83 (dd, J = 16.7, 8.3 Hz, 2H, H-4), 2.02 (dd, J = 7.1, 4.0 Hz, 1H, H-3), 1.31 (m, 1H, H-3).13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 198.14 (s, C-5), 162.35(s, C-4''), 145.41(s, C-3'), 144.80(s, C-4'), 130.71 (s, C-2'', C-6''), 129.30 (s, C-1'), 128.76 (s, C-1''), 117.12 (s, C-6'), 115.72 (s, C-2'), 115.65 (s, C-3'', C-5''), 113.72 (s, C-5'), 92.71 (s, C-1'''), 80.95 (s, C-5'''), 79.19(s,C-1),78.75 (s, C-3'''), 77.00 (s, C-2), 73.66(s, C-2'''), 71. 19 (s, C-4'''), 61.35(s, C-6'''), 33.68 (s, C-4), 19.91 (s, C-3). 以上所得數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對類似化合物進(jìn)行了分析, 以上的光譜數(shù)據(jù)與之前Gupta等[14]發(fā)表的關(guān)于orchioside B(化合物4)的數(shù)據(jù)非常相似. 化合物6的H-2(δ 4.08)、H-3(δ 1.31)與orchioside B的H-2(δ 4.36)、H-3(δ 1.86)的化學(xué)位移存在明顯差異. 同時(shí)，化合物6的C- 2(δ 77)、C-3(δ 19.91)與orchioside B的C- 2(δ 74.4)、C-3(δ 26.8)的化學(xué)位移也呈現(xiàn)出明顯差異. 經(jīng)檢索，這是第一個(gè)關(guān)于化合物6的報(bào)道，是化合物4的同分異構(gòu)體，將其命名為orchioside E，分子式為C23H26O10.化合物6的結(jié)構(gòu)及HMBC相關(guān)信號見圖2.

圖2 化合物6的結(jié)構(gòu)及HMBC相關(guān)信號Fig.2 Structure and selected HMBC correlations of compound 6

化合物7：白色固體.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.61 (s,1H，COOH), 9.21 (s,1H，OH), 7.22 (s, 2H, H-2, H-6), 3.82 (s, 6H，OMe-2, OMe-6);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.71 (s, COOH), 147.89 (s, C-4), 140.64 (s, C-3, C-5), 120.81 (s, C-1), 107.29 (s, C-2, C-6), 56.41 (s, OMe-2, OMe-6). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[12]，鑒定化合物7為丁香酸，分子式為C9H10O5.

化合物8：白色固體. ESI-MS at m/z 460.80 [M - H]-.1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.63 (m, 2H, H-2, H-6), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H，H-5), 5.55 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-1''), 5.10 (d, J = 7.7 Hz, 1H, H-1'), 4.17 (d, J = 9.8 Hz, 1H, H -4''), 3.96 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-2''), 3.88 (m, 4H, OMe, H-6'), 3.76 (m, 2H, H-2', H-4''), 3.68 (dd, J = 12.2, 5.6 Hz, 1H, H-6'), 3.62 (t, J = 9.0 Hz, 1H, H-3'), 3.52 (m, 2H, H-5''), 3.46 (ddd, J = 9.7, 5.6, 2.3 Hz, 1H, H-5'), 3.43 (m, 1H, H-4');13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 168.21(s, C-7)，150.61 (s, C-4), 148.94(s, C-3), 124.37(s, C-6)，123.19 (s, C-1), 114.43 (s, C-5), 112.79 (s, C-2), 108.87 (s, C-1''), 98.96 (s, C-1'), 79.42 (s, C-3''), 77.36(s, C-3'), 76.77 (s, C-5'), 76.52 (s, C-2''), 75.98 (s, C-2'), 74.11 (s, C-4''), 69.97 (s, C-4'), 64.78 (s, C-5''), 61.05 (s, C-6'), 55.02 (s, OMe). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[15]，故化合物8物質(zhì)鑒定為hemsleyanumoide，分子式為C19H26O13，首次在該種植物中發(fā)現(xiàn)，也是首次在仙茅屬中發(fā)現(xiàn).

化合物9：白色粉末. ESI-MS at m/z 358.85 [M - H]-.1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 12.89 (s, 1H, COOH), 7.23 (s, 2H, H-2, H-6), 5.12 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-1'), 3.81 (s, 6H, OMe-2, OMe-6);13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.36 (s, COOH), 152.72 (s, C-3, C-5), 138.69 (s, C-4), 126.09 (s, C-1), 107.81 (s, C-2, C-6), 102.41 (s, C-1'), 77.84 (s, C-3'), 77.10 (s, C-5'), 74.65 (s, C-2'), 70.36 (s, C-4'), 61.28 (s, C-6'), 56.84 (s, OMe-2, OMe-6). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[2]，化合物9鑒定為丁香酸葡萄糖苷，分子式為C15H20O10.

化合物10：白色固體. ESI-MS at m/z 352.69 [M - H]-.13C NMR (151 MHz, MeOD) δ174.13(m, C-7'), 167.64 (m, C-9), 148.13 (s, C-3), 145.64 (s, C-7), 145.37 (s, C-4), 126.43 (s, C-1), 121.56 (s, C-6), 115.12 (s, C-2), 114.03 (s, C-5), 113.83 (s, C-8), 75.17(m, C-1'), 72.93 (s, C-4'), 71.25(m, C-5'), 70.56(m, C-3'), 38.55 (m, C-2'), 36.95 (m, C-6'). 上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故化合物10鑒定為綠原酸，分子式為C16H18O9.

4 討 論

此次分得的化合物主要分為兩大類，即酚酸類物質(zhì)和酚苷物質(zhì). 其中，化合物6為1個(gè)新的酚苷類物質(zhì)，命名為orchioside E；化合物2和8則首次在仙茅科仙茅屬植物中分離得到. 該結(jié)果拓寬了對仙茅物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識，也為合理有效開發(fā)利用該資源提供了科學(xué)依據(jù). 其中屬于酚酸類物質(zhì)的咖啡酸[17]、原兒茶酸[18]、丁香酸[19]、綠原酸[20]在已有報(bào)道中表明具有較好的生物活性. 因此，除酚苷類物質(zhì)代表“仙茅苷”外，具有較好生物活性的酚酸類成分可考慮作為仙茅藥材質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇之一，而對于得到的新物質(zhì)后續(xù)可進(jìn)一步研究其生物活性.