藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制研究

郭小嵐， 李 迪， 汪先花， 顏學(xué)玲， 熊 航， 時 政

(成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所&醫(yī)學(xué)院， 成都 610106)

1 引 言

藥對，作為臨床中醫(yī)遣藥組方常見的配伍形式,組成精煉但基本具備中藥配伍的特征,臨床應(yīng)用行之有效，按照一定的理論依據(jù)和組合原則，將2味相對固定藥物的配伍組合，以發(fā)揮協(xié)同增效或配伍減毒等的作用[1-2].丹參，雙子葉植物唇形科.其藥理作用、臨床應(yīng)用廣泛，歸納得出，在治療心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及抗菌、清除炎癥方面具有重要療效[3].當歸，傘形科植物，其主要化學(xué)成分對機體的造血系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多個系統(tǒng)具有顯著的藥理作用[4].丹參重在活血化瘀，當歸作用補益略偏補血[5]，中藥按照“君臣佐使”的原則配伍一組藥，可達到增效減毒的作用[6-7]，藥對丹參-當歸在神經(jīng)系統(tǒng)方面都有良好的臨床作用，配伍后體外抗氧化能力優(yōu)于單味藥材[8]，既補益又活血化瘀.眾多發(fā)現(xiàn)，丹參和當歸作為單味藥材作用阿爾茨海默病的機制有了一定進展，但目前對于藥對丹參-當歸多成分、多靶點、多代謝途徑作用阿爾茨海默病的機制尚需進一步明確.

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是特征為進行性認知功能障礙和行為損害的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，臨床表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用和失認，以及視空間機能障礙、人格行為改變和執(zhí)行功能障礙等.現(xiàn)治療阿爾茨海默病的常用臨床藥物有多奈哌齊、加蘭他敏、利斯的明、他克林等，但其毒副作用較強.目前發(fā)現(xiàn)，眾多中藥有效成分(如黃酮類、苷類、生物堿類等)對AD有較好的治療作用且毒副作用弱[9].在AD的發(fā)病機制方面存在著很多假說，包括如下：①金屬離子的代謝紊亂和信號通路的改變；②腦供血和營養(yǎng)的不足；③淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、早老素基因(presenilin，PSEN)的突變和載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)等位基因的突變；④線粒體紊亂；⑤神經(jīng)生長因子的缺乏；⑥Aβ毒性假說；⑦Tau假說等[10].雖有眾多假說，但關(guān)于AD的發(fā)病機制目前尚未完全明確.現(xiàn)目前，主要研究乙酰膽堿酯抑制劑和N-甲基-D天門冬氨酸受體阻滯劑干預(yù)阿爾茨海默病，但其并不能逆轉(zhuǎn)疾病過程，且存在副作用較多.因此，對其治療仍然存在很多問題.單一靶點治療疾病臨床效果欠佳，而中藥具有多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣的特點，其次相對比西醫(yī)單靶標、單成分的傳統(tǒng)研究思路來研究中藥，難以體現(xiàn)中藥的系統(tǒng)性[11].因此我們可以利用一個分析平臺，系統(tǒng)地研究中藥作用某一疾病的機制，進行探討研究.現(xiàn)目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在我國已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，包括數(shù)據(jù)收集、靶點預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)分析與可視化、多組分相互作用和信號通路預(yù)測等[12].其主要思想與傳統(tǒng)中醫(yī)藥的整體觀相互補，系統(tǒng)而透徹的分析了中藥治病的作用機制.本文采用此想法，對藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病的機制進行探討研究.

本文采用類藥性(drug-likeness，DL)評估，DL≥0.18，口服利用度(oralbioavailability，OB)≥30%作為篩選標準，然后通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)尋找與候選化合物相關(guān)的潛在靶點，進而在數(shù)據(jù)庫中查閱相關(guān)文獻收集阿爾茨海默病相關(guān)靶點，人工檢索候選化合物的潛在靶點是否與阿爾茨海默病相關(guān)，最后利用Cytoscape3.5.1軟件構(gòu)建候選化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)、靶點-通路網(wǎng)絡(luò)以及化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，為藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 材 料

化學(xué)成分的篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)(http：//lsp.nwsua.edu.cn/tcmsp.php)得到丹參、當歸兩味中藥相關(guān)的所有化學(xué)成分，其中丹參有202個活性成分，當歸有125個活性成分.目標活性成分的篩選標準主要依據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中的建議藥物篩選標準：類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18、口服利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%等.

2.2 方 法

2.2.1 化學(xué)成分靶點預(yù)測和阿爾茨海默病靶點的收集 通過TCMSP平臺尋找丹參、當歸18個化學(xué)成分的相關(guān)潛在靶點.根據(jù)TCMSP平臺所提供的阿爾茨海默病潛在靶點，以及對大量有關(guān)阿爾茨海默病發(fā)病機制文獻的調(diào)研，人工檢索剔除無關(guān)靶點，作用于阿爾茨海默病發(fā)病機制的相關(guān)靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶蛋白校正為官方名稱，潛在靶蛋白信息見表3.

2.2.2 作用網(wǎng)絡(luò)分析 將上一步驟獲取的靶點蛋白信息通過注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)數(shù)據(jù)庫進行GO(Gene Ontology)及KEGG通路注釋.候選化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)、靶點-通路網(wǎng)絡(luò)以及化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建均使用Cytoscape軟件.

3 結(jié) 果

3.1 化學(xué)成分的篩選

通過條件篩選，選取了丹參的16個化學(xué)成分，當歸的2個化學(xué)成分，共有18個化學(xué)成分，當歸的主要活性成分是β-谷甾醇，豆甾醇，見表1；丹參的主要有丹參酮Ⅱ、丹參新酮、隱丹參酮等，見表2.

表1 當歸活性成分及類藥性值

Tab.1 The active components and medical value of Angelicasinensis.

編號Mol IDMolecule NameMWOB/%DLM01MOL000358beta-sitosterol414.7936.910.75MO2MOL000449Stigmasterol412.7743.830.76

表2 丹參活性成分及類藥性值

表3 藥對丹參-當歸活性成分作用潛在靶蛋白的信息

3.2 化學(xué)成分靶點預(yù)測和阿爾茨海默病潛在靶點

丹參、當歸18個化學(xué)成分通過TCMSP分析平臺找到430個靶點.篩選出丹參當歸中與阿爾茨海默病相一致的靶點18個，將這18個靶點投入到Uniprot數(shù)據(jù)庫，得到所有靶點對應(yīng)編號.

3.3 作用網(wǎng)絡(luò)分析

綜合以上得到的數(shù)據(jù)，用軟件Cytoscape3.5.1構(gòu)建候選化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1；靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖2；使用Merge功能將其合并成為化學(xué)物-靶點-通路圖，見圖3；結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路分析.

圖1 化合物-靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖

內(nèi)圈橢圓形表示的是藥對中的活性成分，外圈四邊形表示靶點.

預(yù)測藥對丹參-當歸中具有潛在作用阿爾茨海默病活性成分的化合物-靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖如圖1.當歸中的主要作用成分為β-谷甾醇，豆甾醇，丹參的主要有丹參酮Ⅱ、丹參新酮、隱丹參酮、二氫丹參酮等.這些化學(xué)成分當中含有BCL2、NOS2、PTGS2、CHRM1、CHRM2、CHRNA7、HTA2、HTA3等18個靶點作用于阿爾茨海默病.分析發(fā)現(xiàn)得，甾醇、丹參酮作為潛在化學(xué)成分在抗阿爾茨海默病作用中發(fā)揮著重要作用.

圖2 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

靶點-通路圖可見圖2，GSK-3β參與Wnt信號通路、細胞周期、磷酸化途徑、海馬發(fā)育等通路；CHRM1、CHRM2、NOS2參與鈣離子信號途徑，神經(jīng)受體-配體相互作用；CHRM1、CHRM2作用肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)；還有作用于膽堿能突觸的ACHE、CHRNA7、CHRM2；顯示了不同通路之間也有共同作用的靶點，結(jié)果映射了藥對丹參-當歸作用阿爾茨海默病多個靶點、多個代謝途徑共同協(xié)調(diào)的特點.

從圖3中可以看到，藥對丹參-當歸中的CHRNA7,CHRM1,PTGS2,ACHE,APP,GSK-3β,HTR2A，NOS2為高緯度節(jié)點，這些節(jié)點在AD治療過程中扮演者重要的角色.GO生物學(xué)通路及KEGG代謝通路富集分析，藥對丹參-當歸的活性成分主要作用通路為鈣信號通路、Wnt信號通路、神經(jīng)受體-配體相互作用、海馬發(fā)育、膽堿能突觸、血清能突觸、磷酸化調(diào)控等.說明藥對丹參-當歸通過多成分、多靶點、多種調(diào)節(jié)方式作用阿爾茨海默病.

圖3 化合物-靶點-通路圖

其中外圈六邊形表示參與的通路，中圈四邊形表示作用的靶點，內(nèi)圈橢圓形表示藥對的活性成分

4 討 論

目前，乙酰膽堿酯酶是AD治療的重要靶點.已知美國FDA批準的5個AD治療藥物，其中有4個為AChE抑制劑.它們主要通過抑制AChE催化位點，以減少突觸間隙乙酰膽堿的降解，從而進一步提高ACh水平，促進膽堿能神經(jīng)傳遞功能，進而改善患者的認知和記憶功能[13].治療AD經(jīng)典的靶蛋白膽堿酯酶(CHE)主要有兩類：一為乙酰膽堿酯酶(ACHE)，主要作用水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACH)；二為BCHE.因此存在一種假說：應(yīng)采用針對ACHE以及BCHE的膽堿酯酶抑制劑以治療阿爾茨海默病.

M1受體激動劑(CHRM1)，其通過干預(yù)β淀粉樣蛋白的生長，產(chǎn)生神經(jīng)生長因子樣作用，減弱CHRM1產(chǎn)生的神經(jīng)毒性和tau蛋白的過度磷酸化，以及縮短后超極化的時間等途徑來保護神經(jīng)元細胞[14].M1受體還可以通過與BACE1的直接相互作用,作用BACE1蛋白，降低Aβ的形成，再經(jīng)過蛋白酶體-泛素通路的降解,進一步抑制Aβ的生成和累積，減少具有神經(jīng)毒性的淀粉樣斑沉積[15].CHRM1通過調(diào)節(jié)淀粉樣β前體蛋白APP的代謝，以及作用于tau蛋白，減少過度磷酸化，有助于延緩AD的病情的發(fā)展，提高患者學(xué)習(xí)記憶能力[16].

GSK-3β是GSK-3的一種亞型，GSK-3作為主要的tau激酶，在AD病程發(fā)展中的記憶障礙、小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥、tau蛋白磷酸化、炎性因子的釋放以及突觸丟失和神經(jīng)元死亡等方面，從多途徑發(fā)揮抗AD的作用[15,17].APP代謝異常和tau蛋白異常磷酸化過度是影響阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)展的重要因素.GSK-3β在參與淀粉樣蛋白質(zhì)前體(amyloid precursor protein,APP)代謝的前提下，還作用于tau蛋白過度磷酸化過程，GSK-3β的表達與活性的異常是導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡的常見原因[18-19].故GSK-3β與AD的病理變化有密切的聯(lián)系.APP具有抗Aβ神經(jīng)毒性作用，阻止腦組織神經(jīng)元數(shù)目的減少、斑塊沉積與神經(jīng)元凋亡.

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果見圖3，主要作用通路為MAPK激酶途徑，鈣離子信號途徑、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、神經(jīng)性的配體-受體相互作用Wnt信號通路、細胞周期、細胞凋亡調(diào)控、磷酸化途徑等[20]，這代表藥對丹參-當歸中的活性成分作用于多個靶點及多條代謝通路來干預(yù)AD的發(fā)生發(fā)展.在MAPK激酶途徑中，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激引起細胞產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)進而調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、凋亡，來保護神經(jīng)元組織細胞[21].

從靶點-通路網(wǎng)絡(luò)作用圖中看出APP,GAK-3β對海馬發(fā)育、細胞周期有一定的調(diào)節(jié)作用，而CHRM1.CHRM1,GABRA5,NOS2在神經(jīng)性的配體-受體相互作用上發(fā)揮著重要作用；Wnt信號通路和鈣離子信號途徑，減輕炎癥反應(yīng)，加大細胞存活率，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后機體會啟動Wnt信號通路,進而促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)[22-23]，在某種程度上對阿爾茨海默病有著治療作用.

中藥成分多樣，多靶點多通路協(xié)同作用，通過以上數(shù)據(jù)顯示：藥對丹參-當歸作用于鈣信號通路、Wnt信號通路、神經(jīng)受體-配體相互作用、海馬發(fā)育、膽堿能突觸、血清能突觸、磷酸化調(diào)控等代謝通路，其可以調(diào)節(jié)細胞的周期、抗凋亡、抗炎、抗氧化及保護神經(jīng)元細胞和抑制膽堿酯酶活性，增強突觸形態(tài)改善學(xué)習(xí)記憶障礙從而發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶的能力，發(fā)揮抗阿爾茨海默病作用，但本研究預(yù)測的藥對丹參-當歸潛在化學(xué)成分及其靶點蛋白需要進一步的實驗驗證.