重組GSTA3蛋白對福美雙誘導(dǎo)的肉雞TD中抗凋亡基因BAG-3表達的影響

李楨，楊世雄，牛勝，張寧，李欣，張陽陽，賈云飛，田志雄，寧官保，張鼎，田文霞

重組GSTA3蛋白對福美雙誘導(dǎo)的肉雞TD中抗凋亡基因BAG-3表達的影響

李楨，楊世雄，牛勝，張寧，李欣，張陽陽，賈云飛，田志雄，寧官保，張鼎，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

【】肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（TD）是肉雞常見的一種骨骼性疾病，研究重組GSTA3蛋白對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞軟骨細胞中抗凋亡基因BAG-3表達的影響，為治療TD提供新的思路和方法。將120羽1周齡肉雛雞隨機分為6組（編號為A、B、C、D、E、F組）。A、B、C組為基礎(chǔ)日糧對照組，D、E、F組為添加福美雙日糧誘導(dǎo)TD組。試驗飼喂福美雙2 d誘發(fā)TD，在添加福美雙第1、3、5、7天，腿部肌肉注射重組雞GSTA3蛋白和磷酸鹽緩沖液，A組與D組注射（100 μg·kg-1）磷酸鹽緩沖液；B組與E組注射低劑量（100 μg·kg-1）GSTA3；C組與F組注射高劑量（200 μg·kg-1）GSTA3。試驗歷時23 d。添加福美雙后1、2、4、6、10和15 d采集脛骨生長板。通過Real-time qPCR檢測BAG-3基因的mRNA水平，利用免疫組化來檢測BAG-3蛋白表達水平。Real-time qPCR結(jié)果顯示，TD損傷修復(fù)期內(nèi)，相比較于基礎(chǔ)日糧對照組，福美雙對照組肉雞脛骨生長板中BAG-3 mRNA的表達水平基本都顯著上調(diào)（＜0.05）；相比較于福美雙對照組，E和F組在第2、4、10、15天都有顯著差異，且在第10和15天顯著低于福美雙對照組（＜0.05），表明與D組相比恢復(fù)較快。免疫組化結(jié)果表明BAG-3蛋白在肉雞脛骨軟骨細胞的增殖區(qū)和前肥大區(qū)無表達，只在肥大區(qū)細胞質(zhì)中表達；福美雙組與空白對照組相比，BAG-3蛋白表達增加；福美雙高低劑量組與未注射蛋白的福美雙組相比，重組GSTA3增加了肥大區(qū)的蛋白表達水平（第10和15天）。在福美雙誘導(dǎo)肉雞發(fā)生TD的過程中，GSTA3重組蛋白能夠通過調(diào)控BAG-3表達參與凋亡途徑，抑制細胞凋亡。在TD損傷修復(fù)期，注射GSTA3后使抗凋亡基因BAG-3蛋白表達增強，從而可參與細胞凋亡來緩解TD損傷，使得肉雞TD生長板功能較快地恢復(fù)正常。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A3（GSTA3）；脛骨軟骨發(fā)育不良；BAG-3基因；抗凋亡；肉雞

0 引言

【研究意義】肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（tibial dyschondroplasia, TD）是一種肉雞常見的骨骼疾病，脛骨生長板形成無血管的軟骨栓，使肉雞的脛骨軟骨內(nèi)成骨受阻[1]。TD是目前危害肉雞業(yè)的主要代謝病之一，其致病機理尚不清楚，目前仍無有效的防治方法，TD的發(fā)病機制可能與生長板軟骨細胞相關(guān)凋亡基因的表達調(diào)控有關(guān)[2]。【前人研究進展】Rath等研究了3種二硫代氨基甲酸二甲酯誘導(dǎo)TD發(fā)生，其中福美雙效果最為顯著，通過飼喂福美雙的方法，可在短時間內(nèi)建立與自發(fā)TD臨床表現(xiàn)相似的動物模型[3]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是機體內(nèi)一類十分重要的酶，由Booth等在1961年首次發(fā)現(xiàn)[4]。GSTs有3個亞族，分別為微粒體GSTs、細胞質(zhì)GSTs、細菌磷霉毒抗性GSTs[5]。當(dāng)機體在惡劣條件下，它通過催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的電子基團與還原型谷胱甘肽的疏基結(jié)合，保護細胞使其不受損傷[6]。GSTA3蛋白與已知的GSTs其他酶對催化類固醇激素生物合成的過程相比更有效[7]。田文霞等基因芯片檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSTA3基因表達下調(diào)，福美雙可能影響了GSTs的解毒功能，從而導(dǎo)致肉雞TD的發(fā)生[8]。Bcl-2家族蛋白作為細胞凋亡的主要調(diào)控因子，主要定位于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜上[9]，Bcl-2相關(guān)抗凋亡蛋白3（Bcl-2associated athanogene 3，BAG-3）也被稱為Bis或CAIR- 1，是抗凋亡基因BAG家族的成員之一，Bcl-2相關(guān)抗凋亡家族的C末端均有一段高度保守的功能區(qū)域[10]，因此其進化高度保守。BAG-3通過免疫共沉淀、酵母雙雜交及免疫染色等研究發(fā)現(xiàn)BAG-3能夠與Bcl-2相互作用，共同發(fā)揮抗調(diào)亡作用[11]。BAG-3是一種生存蛋白，在細胞對高溫、重金屬、蛋白酶體抑制和人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）感染等應(yīng)激條件的反應(yīng)過程中被激活而發(fā)揮作用[12]。在急性應(yīng)激和細胞老化過程中，BAG-3可激活蛋白質(zhì)量控制（PQC）系統(tǒng)使細胞蛋白質(zhì)穩(wěn)定，也可參與清除與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白[13]。BAG-3是骨骼肌機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。Rath等與山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)生物制品實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)福美雙可引起血管內(nèi)皮細胞及軟骨細胞凋亡，但是BAG-3在TD肉雞中軟骨細胞的表達情況、GSTA3與細胞凋亡及BAG-3存在什么關(guān)系，尚未見相關(guān)研究?！颈狙芯壳腥朦c】本研究團隊前期研究結(jié)果顯示，重組GSTA3蛋白可能在福美雙誘導(dǎo)的TD中發(fā)揮重要作用，但其對抗軟骨細胞凋亡的作用如何，有待進一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)，研究福美雙誘導(dǎo)的肉雞TD中抗凋亡基因BAG-3的表達以及雞重組GSTA3蛋白對BAG-3表達的影響，探討GSTA3與BAG-3的關(guān)系，以及對TD恢復(fù)的作用，為后期對TD的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 120只1日齡艾維茵（AA）肉雛雞購于山西大象農(nóng)牧集團有限責(zé)任公司。

1.1.2 試驗試劑 福美雙（美國Amresco公司）；重組雞GSTA3蛋白[15]（實驗室自行制備）；BAG-3一抗（bioworld生物公司）；RNAiso plus（Trizol）（AA909-1）（大連寶生物工程公司）、prime script TM RT Reagent Kit（AK3020）（大連寶生物工程公司）、SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（AK6003）(大連寶生物工程公司)；DEPC（Amresco公司）；6×DNA loading buffer（中科瑞泰生物科技有限公司）、DNA ladder（中科瑞泰生物科技有限公司）；50×TAE Buffer（北京博奧拓達科技有限公司）、Agarose-G10（Biowest公司）；甲醛、異丙醇、異戊醇、乙醚、氯仿、氯化鈉、無水乙醇、鹽酸、二甲苯、EDTA均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 試驗地點 試驗于2017年7月至9月，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)生物制品實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 肉雞TD模型建立及生長板的采集 120羽一日齡AA肉雞飼養(yǎng)7 d，隨機分六組（編號為A、B、C、D、E、F組）。A、B、C組為基礎(chǔ)日糧組，D、E、F組為福美雙日糧組（第8、9日齡在飼料中添加福美雙）。第8、10、12、14天，腿部肌肉注射重組雞GSTA3蛋白，A組與D組注射（100 μg·kg-1）磷酸鹽緩沖液；B組與E組注射低劑量（100 μg·kg-1）GSTA3；C組與F組注射高劑量（200 μg·kg-1）GSTA3（表1）。試驗歷時23 d。攻毒后，分別在第1、2、4、6、10、15天，每組選3羽，取脛骨生長板，一部分固定用于免疫組化；一部分凍存，用于定量PCR檢測。

1.2.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測BAG-3蛋白的表達 將各處理組的脛骨生長板用4%的甲醛溶液固定24 h，修塊后固定24 h，置于10%的EDTA中脫鈣24 h，用梯度酒精（50%、70%、75%、80%、90%、100%）脫水2 h，在無水乙醇與二甲苯的1﹕1混合液中20 min，用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ依次透明35 min后，包埋，制片，染色，利用顯微鏡觀察BAG-3蛋白定位及陽性表達結(jié)果。

1.2.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol改進法進行RNA的提取，具體操作方法參考喻進[16]的方法進行。根據(jù)prime scriptTMRT Reagent Kit的說明書進行反轉(zhuǎn)錄，去除基因組DNA，所有操作在冰上完成，最后置于-80℃保存。

1.2.4 Real-time qPCR檢測BAG-3基因mRNA的表達 采用Real-time qPCR對BAG-3基因mRNA的表達進行檢測（表2）。Real-time qPCR反應(yīng)體系如下：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq II（2×），0.25 μL PCR Forward Primer（10 μmol·L-1），0.25 μL PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1），0.1 μL ROX Reference DyeⅡ（50×），1.0 μL RT反應(yīng)液（cDNA溶液），3.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性反應(yīng) 1 cycle，95℃ 3 min；PCR反應(yīng) 42 cycles，95℃ 30 s，55℃ 30 s；溶解曲線分析1 cycle，55℃ 30 s，95℃ 30 s。然后利用2.0% 的瓊脂糖凝膠電泳對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行鑒定。以18S rRNA作為內(nèi)參基因，并用2-△△Ct法計算目的基因在脛骨生長板的相對表達量。

表2 Real-time PCR所用引物

F代表上游引物；R代表下游引物 F means forward primers, R means reverse primers

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS Statistics 17.0軟件對計算出的各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，＜0.05即為差異顯著，差異性的結(jié)果按照統(tǒng)計學(xué)標注方法來區(qū)分顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肉雞生長板BAG-3蛋白表達的情況

免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAG-3蛋白主要在肉雞脛骨軟骨細胞的肥大區(qū)表達，增殖區(qū)和前肥大區(qū)均未表達，定位于細胞質(zhì)中。試驗第1天，與空白對照組（A）相比，低劑量和高劑量的基礎(chǔ)日糧組（B和C）及低劑量和高劑量福美雙組（E和F）無明顯變化，而福美雙對照組（D）表達明顯增強（圖1）；試驗第2天，A組與B、C組表達無明顯變化，D、E與F組表達一致（圖2）；試驗第4天，E組相比D、F組相對減少，趨于正常，和A、B、C組表達情況一致（圖3）；試驗第6天，D表達稍弱，其他無明顯差異（圖4）；試驗第10天，A、B、C表達無明顯差異，D表達增強，E、F相比D表達較弱（圖5）；試驗第15天，A、B、C表達無明顯差異，D強于E、F（圖6）。

2.2 重組GSTA3蛋白對TD肉雞中BAG-3 mRNA水平的調(diào)節(jié)

A.基礎(chǔ)日糧+注射PBS；B.基礎(chǔ)日糧+100 μg·kg-1重組GSTA3蛋白；C.基礎(chǔ)日糧+200 μg·kg-1重組GSTA3蛋白；D.福美雙日糧+注射PBS；E.福美雙日糧+100 μg·kg-1重組GSTA3蛋白；F.福美雙日糧+200 μg·kg-1重組GSTA3蛋白；不同的小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。

P.增殖區(qū)；PH.前肥大區(qū)；H.肥大區(qū)。下圖同

圖4 第6天肉雞生長板BAG-3表達變化

圖5 第10天肉雞生長板BAG-3表達變化

圖6 第15天肉雞生長板BAG-3表達變化

圖7表明，TD損傷修復(fù)期內(nèi)，相比較于基礎(chǔ)日糧對照組，福美雙對照組肉雞脛骨生長板中BAG-3 mRNA的表達水平基本都顯著上調(diào)（＜0.05）；相比較于福美雙對照組，E和F組在第2、4、10、15天都有顯著差異，且在第10和15天顯著低于福美雙對照組（＜0.05），表明與D組相比恢復(fù)較快，并與蛋白表達相一致。

A. 基礎(chǔ)日糧組+ PBS； B. 基礎(chǔ)日糧組+100 μg·kg-1重組GSTA3蛋白； C. 基礎(chǔ)日糧組+200 μg·kg-1重組GSTA3蛋白； D. 福美雙日糧組+ PBS； E. 福美雙日糧組+100 μg·kg-1重組GSTA3蛋白；F. 福美雙日糧組+200 μg·kg-1重組GSTA3蛋白；不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

3 討論

田文霞等和張寧等用福美雙誘導(dǎo)TD后，脛骨近端軟骨增殖區(qū)增厚，前肥大區(qū)和肥大區(qū)加長，軟骨細胞急劇增生、大量調(diào)亡[2,17]。Rath等采取TUNEL法研究發(fā)現(xiàn)，在22日齡TD明顯時，有大量的毛細血管內(nèi)皮細胞和軟骨細胞凋亡[18]。細胞凋亡由不同群體執(zhí)行者和調(diào)控分子及其特異性功能所調(diào)控[19]。抗凋亡基因BAG-3表達越多，表明越能抵抗細胞凋亡。

BAG-3主要分布于細胞質(zhì)，在機體中起抵抗細胞癌變，提高細胞存活率的作用[20]，參與細胞凋亡調(diào)控是BAG-3重要生物學(xué)功能之一，其作用為保護細胞抵御重金屬[21]、高溫[22]及某些藥物的刺激，其機制之一是通過介導(dǎo)蛋白的傳遞過程從而干擾細胞色素c的釋放、凋亡小體的組裝等過程來調(diào)節(jié)細胞凋亡[23]。研究表明，在癌癥和肌病的發(fā)生發(fā)展過程中多功能BAG-3蛋白起著決定性的作用[24]，在胰腺癌細胞中BAG-3基因表達水平較高，可能通過Bcl-2和BAG-3的協(xié)調(diào)作用使細胞發(fā)生抗凋亡[25]；在結(jié)腸癌細胞中BAG-3基因也呈現(xiàn)高表達，促進細胞存活[26]；在膀胱癌細胞中BAG-3是協(xié)同誘導(dǎo)其凋亡的聯(lián)合治療的合適靶點[27]；在心肌細胞中BAG-3促進細胞增殖并抑制細胞凋亡[28]。魏莉[29]等報道，BAG-3在子宮頸癌細胞和組織中呈現(xiàn)高表達，從而參調(diào)控細胞凋亡。有試驗研究指出，BAG-3在紅細胞中的表達與TD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[30]。本研究結(jié)果表明，在誘導(dǎo)TD發(fā)生后的第1、2和4天，BAG-3表達量相比健康組低，而在第10、15天BAG-3表達量則較高，說明機體發(fā)生TD后會產(chǎn)生一種防御機制來抵抗細胞的非正常性凋亡。試驗第1、2、4、10天，D、E和F組BAG-3蛋白的陽性表達是相同的；第6天E組陽性表達量高于D組，而F組與D組表達一致；第15天，E和F組表達情況均高于D組。說明低劑量和高劑量重組GSTA3后期對機體都有輕微的解毒作用。Real-time PCR試驗表明，TD發(fā)生后，BAG-3基因mRNA表達水平也顯著上調(diào)；注射GSTA3蛋白后，第2、4、10、15天有顯著差異，說明肉雞TD生長板軟骨細胞的凋亡受BAG-3基因調(diào)控，而重組GSTA3蛋白可能通過調(diào)控BAG-3基因的表達，調(diào)節(jié)軟骨細胞凋亡。

4 結(jié)論

重組GSTA3蛋白可能通過調(diào)控抗凋亡蛋白3抗凋亡因子的表達，抑制細胞凋亡。在脛骨軟骨發(fā)育不良損傷修復(fù)期，注射GSTA3后使抗凋亡基因抗凋亡蛋白3蛋白表達增強，從而可能參與細胞凋亡來緩解脛骨軟骨發(fā)育不良損傷，使脛骨軟骨發(fā)育不良生長板的功能恢復(fù)。因此，GSTA3對預(yù)防肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的發(fā)生具有重要的指導(dǎo)意義和很好的臨床應(yīng)用前景。

[1] SHAHZAD M, LIU J, GAO J, WANG Z, ZHANG D, NABI F, LI K, LI J. Differential expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN/CD147) in avian tibial dyschondroplasia., 2015, 44(1): 13-18.

[2] 張寧, 李欣, 寧官保, 張鼎, Ali Raza Jahejo, 李宏全, 馬海利, 郝衛(wèi)芳, 高文偉, 趙宇軍, 高詩敏, 李桂蘭, 李建慧, 閆芳, 高榮琨, 田文霞. 福美雙誘導(dǎo)的肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良軟骨細胞凋亡. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2017, 48(12): 2421-2428.

ZHANG N, LI X, NING G B, ZHANG D, ALI R J, LI H Q, MA H L, HAO W F, GAO W W, ZHAO Y J, GAO S M, LI G L, LI J H, YAN F, GAO R K, TIAN W X. Apoptosis of chondrocytes in tibial dyschondroplasia induced by thiram in broilers., 2017, 48(12): 2421-2428. (in Chinese)

[3] RATH N C, HUFF W E, BALOG J M, HUFF G R. Comparative efficacy of different dithiocarbamates to induce tibial dyschondroplasia in poultry., 2004, 83(2), 266-274.

[4] BOOTH J, BOYLAND E, SIMS P. An enzyme from rat liver catalysing conjugations with glutathione., 1963, 79(3): 516.

[5] 雷安平, 陳歡, 黎雙飛, 胡章立. 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的功能、應(yīng)用及克隆表達. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2009, 32(12): 85-91.

LEI A P, CHEN H, LI S F, HU Z L. Function, application and cloning expression of glutathione s-transferase., 2009, 32(12): 85-91. (in Chinese)

[6] 馮雪, 王彬, 孫艷香. 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的研究進展. 生物學(xué)教學(xué), 2012, 37(6): 5-6.

FENG X, WANG B, SUN Y X. Research progress of glutathione sulfur transferase., 2012, 37(6): 5-6. (in Chinese)

[7] JOHANSSON A S, MANNERVIK B. Human glutathione transferase A3-3, a highly efficient catalyst of double-bond isomerization in the biosynthetic pathway of steroid hormones., 2001, 276(35): 33061-33065.

[8] 寧官保, 田文霞, 王瑞, 覃平, 喬建鋼, 李宏全, 李家奎, 畢丁仁, 潘思軼, 郭定宗. 福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良早期生長板消減cDNA文庫的構(gòu)建. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(4): 829-834.

NING G B, TIAN W X, WANG R, QIN P, QIAO J G, LI H Q, LI J K, BI D R, PAN S Y, GUO D Z. Construction of early growth plate subtraction cDNA library induced by thiram in broilers with tibial chondrodysplasia., 2011, 44(4): 829-834. (in Chinese)

[9] 卿晨, 丁健. Bcl-2基因家族在調(diào)節(jié)細胞凋亡中的作用. 國外醫(yī)學(xué): 分子生物學(xué)分冊, 2000(1): 17-21.

QING C, DING J. The role of Bcl-2 gene family in regulating apoptosis., 2000(1): 17-21. (in Chinese)

[10] TAKAYAMA S, XIE Z, REED J C. An evolutionarily conserved family of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulators., 1999, 274(2): 781.

[11] 趙謙, 殷小成, 彭艷輝. 二烯丙基二硫誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡及其對Bax、Bag-1表達的影響. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2012, 12(2): 231-234.

ZHAO Q, YIN X C, PENG Y H. Apoptosis of human leukemia K562 cells induced by diallyl disulfide and its effects on expression of Bax and bag-1., 2012, 12(2): 231-234. (in Chinese)

[12] WANG H Q, MENG X, LIU B Q, LI C, GAO Y Y, NIU X F, LI N, GUAN Y F, DU Z X. Involvement of JNK and NF-κB pathways in lipopolysaccharide (LPS)-induced BAG3 expression in human monocytic cells., 2011, 318(1): 16-24.

[13] STURNER E, BEHL C. The role of the multifunctional BAG3 protein in cellular protein quality control and in disease., 2017, 10: 177.

[14] 趙紅, 張意, 王軍, 權(quán)金星. BAG3蛋白在臨床應(yīng)用中的研究進展. 甘肅醫(yī)藥, 2018, 37(8): 685-688.

ZHAO H, ZHANG Y, WANG J, QUAN J X. Advances in clinical application of BAG3 protein., 2018, 37(8): 685-688. (in Chinese)

[15] 盧曉曉. 肉雞谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A3基因的克隆及蛋白的表達和純化[D]. 太谷: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

LU X X. Cloning, expression and purification of broilers Glutathione S-Transferase A3[D]. Taigu：Shanxi Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[16] 喻進. 塞來昔布對福美雙誘導(dǎo)的肉雞TD中COX-1/2, ColX和MMP-13表達的影響[D]. 太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

YU J. Effect of celecoxib on the expression of COX-1/2, ColX and MMP-13 in fumite-induced broiler TD [D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[17] 田文霞, 李家奎, 畢丁仁, 張艷紅, 覃平, 韓秀萍. 福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的組織病理學(xué)變化. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2007(6): 899-902.

TIAN W X, LI J K, BI D R, ZHANG Y H, QIN P, HAN X P. Histopathological changes of tibial chondrodysplasia induced by thiram in broiler chickens., 2007(6): 899-902. (in Chinese)

[18] RATH N C, RICHARDS M P, HUFF W E, HUFF G R, BALOG J M. Changes in the tibial growth plates of chickens with Thiram-induced Dyschondroplasia., 2005, 133(1): 41-52.

[19] MUKHOPADHYAY S, PANDA P K, SINHA N, DAS A N, BHUTIA S K. Autophagy and apoptosis: where do they meet., 2014, 19(4): 555-566.

[20] ROSATI A, GRAZIANO V, De L V, PASCALE M, TURCO M C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways., 2011, 2(4): e141.

[21] PAGLIUCA M G, LEROSE R, CIGLIANO S, LEONE A. Regulation by heavy metals and temperature of the human BAG‐3 gene, a modulator of Hsp70 activity., 2003, 541(1): 11-15.

[22] LIAO Q, OZAWA F, FRIESS H, ZIMMERMANN A, TAKAYAMA S, REED J C, KLEEFF J, BUCHLER M W. The anti-apoptotic protein BAG-3 is overexpressed in pancreatic cancer and induced by heat stress in pancreatic cancer cell lines., 2001, 503(2): 151-157.

[23] ROSATI A, AMMIRANTE M, GENTILELLA A, BASILE A, FESTA M, PASCALE M, MARZULLO L, BELISARIO M A, TOSCO A, FRANCESCHELLI S, MOLTEDO O, PAGLIUCA G, LEROSE R, TURCO M C. Apoptosis inhibition in cancer cells: a novel molecular pathway that involves BAG3 protein., 2007, 39(7): 1337-1342.

[24] 何麗囡, 李文君, 黃韜, 林成源, 尹俊林, 樊保敏, 曾廣智, 卞兆祥. Bag3 P215L基因突變小鼠的繁殖與基因型鑒定. 云南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2019(5): 433-438.

HE L N, LI W J, HUANG T, LIN C Y, YIN J L, FAN B M, ZENG G Z, BIAN Z X. Reproduction and genotype identification of Bag3 P215L.(), 2019(5): 433-438. (in Chinese)

[25] 廖泉, 胡亞, 趙玉沛. 胰腺癌細胞中抗凋亡蛋白BAG-3的過度表達. 中華肝膽外科雜志, 2003(8): 33-37.

LIAO Q, HU Y, ZHAO Y P. Overexpression of anti-apoptotic protein BAG-3 in pancreatic cancer cells., 2003(8): 33-37. (in Chinese)

[26] 曹艷莎, 李婳, 陳明紅, 劉寶琴, 王華芹, 李寧. 組織芯片技術(shù)檢測BAG3蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義. 吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2017, 43(6): 1177-1181.

CAO Y S, LI H, CHEN M H, LIU B Q, WANG H Q, LI N. Tissue chip technology to detect BAG3 protein expression in the colon cancer tissue and its clinical significance., 2017, 43(6): 1177-1181. (in Chinese)

[27] MANI J, ANTONIETTI P, RAKEL S, BLAHETA R, BARTSCH G, HAFERKAMP A, KOGEL D. Knockdown of BAG3 sensitizes bladder cancer cells to treatment with the BH3 mimetic ABT-737., 2016, 34(2): 197-205.

[28] ZHANG J, HE Z, XIAO W, NA Q, WU T, SU K, CUI X. Overexpression of BAG3 attenuates hypoxia-induced cardiomyocyte apoptosis by inducing autophagy., 2016, 39(2): 491-500.

[29] 魏莉, 秦曉鵬, 趙興波, 王偉. Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因3參與子宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2017, 52(8): 551-557.

WEI L, QIN X P, ZHAO X B, WANG W. Mechanism of Bcl-2 combined with anti-apoptotic gene 3 in the epithelial mesenchymal transformation of cervical cancer., 2017, 52(8): 551-557. (in Chinese)

[30] WANG C X, NIU S, JAHEJO A R, JIA F J, LI Z, ZHANG N, NING G B, ZHANG D, LI H Q, MA H L, HAO W F, GAO W W, GAO S M, LI J H, LI G L, YAN F, GAO R K, ZHAO Y J, CHEN H C, TIAN W X. Identification of apoptosis-related genes in erythrocytes of broiler chickens and their response to thiram-induced tibial dyschondroplasia and recombinant glutathione-S-transferase A3 protein., 2018, 120: 11-16.

Effect of Recombinant GSTA3 Protein on Expression of the Anti-Apoptotic Gene BAG-3 in Thiram-induced Tibial Chondrodysplasia

LI Zhen, YANG ShiXiong, NIU Sheng, ZHANG Ning, LI Xin, ZHANG YangYang, JIA YunFei, TIAN ZhiXiong, NING GuanBao, ZHANG Ding, TIAN WenXia

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【】 Tibial chondrodysplasia (TD) is a common skeletal disease in broilers. The study was conducted to investigate the effect of recombinant GSTA3 protein on the expression of anti-apoptotic gene BAG-3 in the chondrocytes of broilers induced by thiram, so as to provide a new idea and method for the treatment of TD. 【】120 one-week-old broiler chicks were randomly divided into six groups (A, B, C, D, E and F), in which Group A, B and C were basic diet groups, and group D, E and F were thiram-containing diet groups.TD was induced by thiram for 2 days. After thiram was added for days 1, 3, 5 and 7, recombinant chicken GSTA3 protein and phosphate buffer were injected into the leg muscles. Group A and group D were injected with PBS (100 μg·kg-1); group B and group E were injected with low dose (100 μg·kg-1) GSTA3; group C and group F were injected with high dose (200 μg·kg-1) GSTA3. The experiment lasted 23 days. Tibia growth plates were collected at the 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th and 15th days after thiram treatment. The mRNA level of BAG-3 gene was detected by quantitative PCR, and the protein expression of BAG-3 gene was observed by immunohistochemistry.【】 Real-time PCR results showed that the expression level of BAG-3 mRNA in tibia growth plate of broilers in the thiram-containing diet group was significantly increased, compared with that in the basal diet control group during the repair period of TD injury (＜0.05). Compared with the thiram-containing diet group, E and F groups had significant differences on days 2, 4, 10 and 15, and were significantly lower than that under the thiram-containing diet group on days 10 and 15 (＜0.05), indicating a faster recovery compared with group D. Immunohistochemical results showed that BAG-3 protein was not expressed in the proliferation area and the pre-hypertrophic area of the chicken tibial chondrocytes, but only in the cytoplasm of the hypertrophic area. Compared with the control group A, the expression of BAG-3 protein in the thiram-containing diet group was increased. The recombinant GSTA3 induced the protein expression level in the hypertrophic area in the high and low dose of GSTA3 group compared with the thiram-containing diet group D (days 10 and 15). 【】 In conclusion, GSTA3 recombinant protein could regulate the expression of BAG-3 to participate in the apoptosis pathway and inhibit the apoptosis during the induction of TD in broilers. During the TD-injury repair period, after GSTA3 injection, the expression of anti-apoptotic gene BAG-3 protein was enhanced, which could participate in cell apoptosis to alleviate the TD-injury and make the TD growth plate function of broilers return to normal quickly.

glutathione S-transferase A3 (GSTA3); tibial dyschondroplasia; BAG-3; antiapoptotic; broiler

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.018

2019-05-20；

2019-12-26

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500806）、2017年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201710113001）、2017年山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2017081）、山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2017-073）、晉中市重點科技創(chuàng)新平臺（P171002-3）、國家自然科學(xué)基金（31072179）、山西省科技攻關(guān)項目（20130311027-3）

李楨，E-mail：1091856050@qq.com。通信作者田文霞，E-mail：wenxiatian@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）