不同根系分泌物對土壤N2O排放及同位素特征值的影響

莊姍，林偉，丁軍軍，鄭欠，寇馨月，李巧珍，李玉中,2

不同根系分泌物對土壤N2O排放及同位素特征值的影響

莊姍1，林偉1，丁軍軍1，鄭欠1，寇馨月1，李巧珍1，李玉中1,2

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部旱地節(jié)水農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【】探究植物根系分泌的主要組分（有機(jī)酸、氨基酸、糖類）對土壤N2O排放及其微生物過程的影響，為選擇適宜的植物進(jìn)而控制土壤N2O排放提供支撐。通過室內(nèi)試驗(yàn)分別添加草酸、絲氨酸、葡萄糖于土壤中模擬根系的3種主要分泌物，每種分泌物設(shè)置兩個(gè)濃度水平：低濃度（150 μg C·d-1）和高濃度（300 μg C·d-1），另設(shè)置添加蒸餾水的對照組，共7個(gè)處理。將土壤置于120 mL玻璃瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h內(nèi)采集氣體樣品7次，每次培養(yǎng)2 h，獲取N2O排放速率、日累積排放量和同位素特征值（15Nbulk18O和SP（site preference，SP=15Nα-15Nβ））。添加3種根系分泌物組分后，土壤N2O排放速率均逐漸升高，且均高于對照。高濃度處理組N2O累積排放量為：葡萄糖（（3.2±1.3）mg·kg-1·d-1）處理＞絲氨酸（（2.6±0.5）mg·kg-1·d-1）處理＞草酸（（1.4±0.2）mg·kg-1·d-1）處理，低濃度處理組為：草酸（（2.7±1.3）mg·kg-1·d-1）處理＞絲氨酸（（1.8±0.4）mg·kg-1·d-1）處理＞葡萄糖（（1.6±0.8）mg·kg-1·d-1）處理；添加根系分泌物的不同處理間土壤N2O的18O值無明顯差異，并穩(wěn)定在24.1‰—25.6‰，且均顯著高于對照（（20.1±1.5）‰）；土壤N2O的15Nbulk值與添加根系分泌物的種類有關(guān)，其中草酸處理組為（-20.06±2.22）‰、絲氨酸處理組為（-22.33±1.10）‰、葡萄糖處理組為（-13.86±1.11）‰、對照組為（-23.14±3.72）‰。各處理土壤N2O的SP值的變化范圍為13.13‰—15.03‰，根系分泌物濃度越高，SP值越低。綜合分析不同處理4個(gè)指標(biāo)（N2O排放速率、N2O的15Nbulk18O和SP值）的不同時(shí)刻的檢測值與日均值的校正系數(shù)，添加根系分泌物后第16小時(shí)各處理4個(gè)指標(biāo)的校正系數(shù)最接近于1。在NH+ 4-300 mg N·kg-1的土壤環(huán)境下根系分泌物促進(jìn)N2O的排放，且在培養(yǎng)期間（24 h）土壤N2O排放速率逐漸升高。高濃度處理組葡萄糖對土壤N2O排放速率促進(jìn)效果最強(qiáng)，低濃度處理組草酸對土壤N2O排放速率促進(jìn)效果最強(qiáng)。與對照組相比，根系分泌物的添加使N2O的18O值顯著升高；與對照組相比，葡萄糖的添加使15Nbulk值顯著升高。根系分泌物濃度越高，反硝化作用對N2O的貢獻(xiàn)越大。

根系分泌物；硝化作用；反硝化作用；N2O；同位素特征值

0 引言

【研究意義】N2O是一種重要的溫室氣體，能夠破壞平流層中的臭氧層且參與大氣中光化學(xué)反應(yīng)，從而進(jìn)一步加劇溫室效應(yīng)[1]。土壤是N2O的主要排放源[1-2]，約占全球N2O排放總量的65%[3]。自20世紀(jì)初合成氨技術(shù)發(fā)明以來，氮肥被大量的投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在增加作物產(chǎn)量的同時(shí)也使得N2O排放量增加了19%[4-6]。而菜地具有高水、高肥、肥料利用率低等特點(diǎn)[7]，造成了N2O的大量排放。因此研究菜地N2O排放對減緩全球變暖具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】硝化作用和反硝化作用是N2O產(chǎn)生的主要過程[8]。傳統(tǒng)的研究方法主要有乙炔抑制法和同位素標(biāo)記法等，這些方法在實(shí)際操作過程中都有一些局限性，如抑制劑（乙炔）和標(biāo)記物在系統(tǒng)中擴(kuò)散不均，易受系統(tǒng)干擾等[9-10]。而自然豐度條件下的N2O同位素位嗜值（SP值）不受N2O前體同位素的影響，進(jìn)而克服土壤與N作用的環(huán)境阻礙而直接評價(jià)N2O產(chǎn)生的微生物過程，是估測N2O來源及貢獻(xiàn)的一種有效方法[11]。盡管N2O的15Nbulk和18O值易受底物同位素影響，但也能夠在一定程度上反應(yīng)微生物過程，其與SP值相結(jié)合進(jìn)行分析有助于更加全面了解N2O的排放行為。N2O排放的影響因素很多，其中對土壤孔隙含水量（WFPS）[12-13]、pH[14]、O2濃度[15]、溫度[16-18]等研究較多。然而，植物通過根系分泌物對N2O的產(chǎn)生也具有重要的影響。植物凈光合固定的碳5%—25%通過根系分泌物流失到土壤中[19-21]，并以有機(jī)酸，氨基酸，糖類和其他類型分子的形式釋放，是土壤重要的碳源，影響土壤硝化和反硝化作用[22-23]；根系分泌物還可以作為電子供體還原NO- 3和NO- 2[24]，改變N2O產(chǎn)生的電子傳遞途徑；還可通過改變根際周圍微生物的群落結(jié)構(gòu)影響N2O的產(chǎn)生[25]。草酸、絲氨酸、葡萄糖分別是根系分泌物中普遍存在并且含量較多的一種低分子有機(jī)酸、氨基酸、糖類[26]，它們在N2O產(chǎn)生過程中的作用機(jī)理存在一定差異。研究發(fā)現(xiàn)草酸顯著促進(jìn)土壤中有機(jī)態(tài)氮和有機(jī)無機(jī)復(fù)合態(tài)氮的礦化速度，促進(jìn)氮的釋放[27]。也有研究表明草酸促進(jìn)N2O還原基因的復(fù)制，對N2O的還原產(chǎn)生影響[28]。葡萄糖也能夠促進(jìn)氮的分解，但這種促進(jìn)作用明顯小于草酸，此外，優(yōu)先利用葡萄糖的微生物可能導(dǎo)致氮分解率下降[28]。絲氨酸不僅是細(xì)胞蛋白質(zhì)的重要組成部分，也是微生物的能量來源，在土壤中可以礦化為NH+ 4，改變土壤的C/N和pH[29]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同植物根系分泌物的組成和含量不同，大量研究表明N2O的排放與根系分泌物的組成和含量有關(guān)[24-25,29-30]，但鮮有系統(tǒng)研究不同組分單獨(dú)作用對N2O產(chǎn)生過程的影響。又由于根系分泌物組成和土壤環(huán)境的復(fù)雜，在自然條件下很難做到定量提取研究[31]，所以通過模擬根系分泌物組分和含量制備根系分泌物溶液添加到土壤中是研究根系分泌物作用下土壤N2O排放特征的重要方法。盡管實(shí)驗(yàn)室環(huán)境能夠控制土壤溫度、濕度等環(huán)境因子以減少環(huán)境差異對N2O排放的影響，但添加根系分泌物后微生物對各根系分泌物的相互作用和響應(yīng)時(shí)間是影響N2O排放量的關(guān)鍵，N2O排放的時(shí)空變異性對定量分析不同根系分泌物組分對N2O產(chǎn)生作用的影響仍無法排除。因此研究不同根系分泌物組分對土壤N2O排放的影響，同時(shí)確定合理的氣體取樣時(shí)間，對于提高試驗(yàn)效率，深入研究根系分泌物對N2O產(chǎn)生在時(shí)間和空間上的作用至關(guān)重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對根系分泌物中3種主要組分（有機(jī)酸、絲氨酸、糖類）的主要成分（草酸、絲氨酸、葡萄糖）作用下土壤N2O排放和同位素特征的綜合分析，揭示不同根系分泌物對土壤N2O產(chǎn)生過程的影響及其作用機(jī)制，為選擇適宜的植物進(jìn)而減緩?fù)寥繬2O排放提供支撐。

1 材料與方法

1.1 土壤采集

土壤采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所順義實(shí)驗(yàn)基地，東經(jīng)40°05′2″，北緯116°55′19″。基地為典型的暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，年平均日照2 684 h，年平均氣溫12.5℃，年平均降水量623.5 mm，無霜期195 d左右。土壤類型為潮褐土，土壤密度1.40 g·cm-3，有機(jī)質(zhì)16.48 g·kg-1，全氮1.10 g·kg-1, 全磷0.68 g·kg-1，全鉀20.31 g·kg-1，pH 8.7。

土壤采集于2018年8月（雨后2 d），取0—20 cm表層土壤于陰涼處自然風(fēng)干。除去砂石、植物根系等雜質(zhì)，過2 mm篩，室內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

選擇3種代表性有機(jī)物，即草酸代表有機(jī)酸，絲氨酸代表氨基酸，葡萄糖代表糖類，以此為研究對象。依據(jù)白菜根系分泌速率[26]，設(shè)置2個(gè)添加水平：150 μg C·d-1（低濃度）和300 μg C·d-1（高濃度），另添加蒸餾水為空白對照，共7個(gè)處理，每次添加溶液體積為0.85 mL，每種處理設(shè)3次重復(fù)。用120 mL密封性良好的血清瓶作培養(yǎng)瓶，稱取40 g風(fēng)干土放入120 mL血清瓶中，共21個(gè)。用蒸餾水調(diào)節(jié)土壤孔隙含水量（WFPS：water-filled-pore-space）至75%左右（稱重法），放入25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗預(yù)培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)前重量每4天補(bǔ)充一次水分（日蒸發(fā)量約為0.85 mL），共補(bǔ)充3次。第12天補(bǔ)充水分的同時(shí)施入(NH4)2SO4溶液（300 mgN·kg-1干土，足量氮使微生物對根系分泌物敏感，且使土壤產(chǎn)生的N2O同位素豐度在儀器測結(jié)果最準(zhǔn)確的范圍內(nèi)）。在第14天用2.5 mL一次性注射器依次吸取草酸、絲氨酸、葡萄糖溶液和蒸餾水，插入土壤緩慢推動(dòng)注射器使溶液緩慢送出，作為正式培養(yǎng)第1天，之后每隔24 h添加一次。盡管絲氨酸能夠提供N素，但是培養(yǎng)期間添加絲氨酸N素的總量不足土壤總氮的3%，對N2O排放量的影響較小。

1.3 主要藥品及規(guī)格

草酸（H2C2O4·2H2O）：分析純，北京化工廠；D-無水葡萄糖（C6H12O6）：＞99.9%，MYM Biological Technology；絲氨酸（C3H7NO3）：99%，北京百靈威科技有限公司；硫酸銨（(NH 4)2SO4）：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.4 氣體樣品采集

在正式培養(yǎng)的第3天，添加根系分泌物溶液后的第2、4、8、12、16、20和24小時(shí)取樣，共采集7次。采樣前將培養(yǎng)瓶蓋上橡膠塞和鋁蓋，并用密封器壓緊密封，培養(yǎng)2 h。其他時(shí)間保持培養(yǎng)瓶敞口。用50 mL針筒抽取30 mL氦氣注入培養(yǎng)瓶中，來回抽動(dòng)針筒重復(fù)3次，將氣體混勻，再將針筒抽到30 mL刻度處，待針筒不回彈后拔出并迅速插入已抽成真空的20 mL血清瓶，做好標(biāo)記。取樣的同時(shí)抽取實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣作為N2O的環(huán)境背景值（3次重復(fù)）。

1.5 樣品測定與方法：

1.5.1 N2O同位素特征值測定與校正 穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（Delta V Plus‐Precon, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）用來測定N2O同位素特征值：15Nα15Nbulk18O計(jì)算公式如下[32]：

18O(‰)（2）

式中，=15N/14N，=18O/16O。sa表示樣品，st表示標(biāo)準(zhǔn)物。15N和18O的標(biāo)準(zhǔn)分別是大氣中的N2和維也納標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水（Vienna Standard Mean Ocean Water），校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)怏w（美國液化空氣特種氣體有限責(zé)任公司（Air Liquide America, Specialty Gases LLC））。

由于測定的N2O為空氣中和土壤產(chǎn)生的N2O的混合氣，受空氣同位素值的影響，各檢測結(jié)果（15Nα15Nbulk18O）需按照如下公式校正[33]：

式中，soil-emitted代表土壤排放N2O的同位素值；mix、mix分別表示土壤與空氣混合氣體的同位素值和N2O濃度；air、air分別表示空氣背景的同位素值和N2O濃度（0.63 mg·m-3。mix-air為土壤排放的N2O濃度。

由于土壤N2O排放具有時(shí)間變異性，N2O的日平均同位素特征值用通量的加權(quán)平均值來表示[34]：

式中，wa表示同位素的日通量加權(quán)平均值。e表示第-1取樣到次取樣時(shí)間內(nèi)土壤排放N2O的量（時(shí)刻的排放速率×?xí)r間間隔（2 h 或4 h））。δ表示次取樣檢測的同位素特征值。

1.5.2 N2O來源確定的理論基礎(chǔ) N2O為直線型分子：Nβ-Nα=O。根據(jù)兩個(gè)氮原子與氧原子的相對位置不同，則中間的氮原子命名為α氮原子，末端的氮原子為β氮原子[32]。自然豐度條件下N2O分子中15N原子出現(xiàn)在α位和β位的差異，稱為同位素位嗜值（site preference），即SP值，計(jì)算公式如下[35-36]：

=15Nα-15Nβ（6）

在不同微生物群落或酶參與下的不同反應(yīng)過程產(chǎn)生的N2O的值不同，這是值用于土壤N2O溯源研究的重要理論基礎(chǔ)。純細(xì)菌培養(yǎng)下硝化作用和反硝化作用的值是已知的，且其值不受底物氮氧同位素的影響。但自然狀況下這兩種過程往往同時(shí)存在[32]，為測定氣體樣品中N2O的同位素值，通常利用同位素二源混合模型計(jì)算硝化作用和反硝化作用對N2O的貢獻(xiàn)[37]。公式如下：

N=1-D（8）

式中，N和D分別表示N2O來自土壤中硝化和反硝化作用的貢獻(xiàn)比例N表示純細(xì)菌培養(yǎng)條件下硝化作用的值，為33‰[38-39]；D表示純細(xì)菌培養(yǎng)條件下反硝化作用的值，為0‰[40-41]；sa表示測得樣品的SP值，樣品值大于33‰或小于0‰均按33‰或0‰計(jì)算。

1.5.3 N2O排放速率的計(jì)算 采集的氣體用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（Delta V Plus-Preco，Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany）結(jié)合痕量氣體濃縮系統(tǒng)測定N2O氣體峰面積，根據(jù)N2O在樣品中峰面積與環(huán)境背景中峰面積的比值，計(jì)算樣品N2O濃度，根據(jù)培養(yǎng)前后瓶內(nèi)N2O的濃度變化計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)土壤N2O的排放速率（培養(yǎng)前以及環(huán)境背景氣體N2O的體積分?jǐn)?shù)為320 nmol·mol-1）。公式如下[42]：

式中，表示N2O排放速率（μg·kg·h-1），22.4為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的摩爾體積（L·mol-1）。為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O氣體的摩爾質(zhì)量（44 g·mol-1）。1000為單位換算。表示培養(yǎng)瓶的體積，0.09 L。sa、air分別表示培養(yǎng)后瓶內(nèi)氣體和空氣中N2O濃度（nmol·mol-1）。Δ為培養(yǎng)時(shí)間，2 h。為培養(yǎng)溫度，25℃。

1.5.4 N2O通量和同位素值的校正系數(shù) 各采樣時(shí)刻N(yùn)2O排放速率和日平均排放速率的校正，各采樣時(shí)刻測得的同位素值和同位素的日均值之間的校正公式如下[43-44]：

式中，F（=2、4、8、12、16、20、24）表示各時(shí)間的平均通量。C為校正系數(shù)，ave為N2O日平均排放速率、15Nbulk、18O和SP的日平均值，其中15Nbulk、18O和SP的日平均值為各時(shí)刻排放速率的加權(quán)平均值（根據(jù)公式（5）計(jì)算）。F為實(shí)測的第次實(shí)測通量，或第次取樣檢測的同位素值。校正系數(shù)越接近1，則說明該時(shí)刻測量的N2O排放速率和同位素值越接近日平均值，測量結(jié)果越具有代表性，即可采用該時(shí)刻作為最佳的取樣時(shí)間[45]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel·2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和做圖。用SPSS·25.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各處理間N2O累計(jì)排放量，18O，15Nbulk和SP用單因素方差分析（One-Way ANOVA），LSD法進(jìn)行多重比較。雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）比較根系分泌物組分和濃度及其交互作用對N2O排放量和同位素特征值的影響。用一元線性回歸分析最佳采樣時(shí)間的檢測值和日均值間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 N2O排放速率的日變化

如圖1所示，在取樣期間所有處理的N2O排放速率均呈上升趨勢，添加根系分泌物處理組均高于對照。在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)添加低濃度、高濃度草酸處理土壤N2O排放速率迅速升高，分別從13.21 μg·kg-1·h-1增加到226.28 μg·kg-1·h-1和從17.84 μg·kg-1·h-1增加到97.21 μg·kg-1·h-1，添加草酸后土壤N2O排放速率，低濃度處理組高于高濃度處理組；葡萄糖處理中低濃度組低于高濃度組，低濃度絲氨酸、高濃度絲氨酸、低濃度葡萄糖和高濃度葡萄糖處理的土壤N2O排放速率分別從70.72 μg·kg-1·h-1增加到125.79 μg·kg-1·h-1、50.82 μg·kg-1·h-1增加到171.71 μg·kg-1·h-1、20.34 μg·kg-1·h-1增加126.69 μg·kg-1·h-1和20.46 μg·kg-1·h-1增加到185.21 μg·kg-1·h-1。

雙因素方差分析顯示N2O累計(jì)排放量受根系分泌物和濃度共同作用的影響（＜0.05）（表1）。N2O累計(jì)排放量低濃度處理組：草酸處理＞絲氨酸處理＞葡萄糖處理，而在高濃度處理組：葡萄糖處理＞絲氨酸處理＞草酸處理。單因素方差分析顯示，低濃度草酸、高濃度絲氨酸和高濃度葡萄糖處理土壤N2O累計(jì)排放速率顯著高于對照（＜0.05）。增加根系分泌物濃度時(shí)，僅高濃度葡萄糖處理N2O累計(jì)排放量顯著高于低濃度葡萄糖處理（＜0.05）。

誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差（n=3）。下同

表1 N2O累計(jì)排放量和同位素日加權(quán)平均值

CL：150 μg C·d-1草酸處理；CH：300 μg C·d-1草酸處理；AL：150 μg C·d-1絲氨酸處理；AH：300 μg·C·d-1絲氨酸處理；PL：150 μg C·d-1葡萄糖處理；PH：300 μg·C·d-1葡萄糖處理；Control：蒸餾水處理（對照）。下同

CL: 150 μg C·d-1Oxalic acid treatment; CH: 300 μg·C·d-1Oxalic acid treatment; AL:150 μg C·d-1serine treatment; AH:300 μg C·d-1serine Treatment; PL:150 μg C·d-1glucose treatment; PH: 300 μg C·d-1glucose treatment; Control: Distilled water treatment. The same as below

18O，15Nbulk和SP的值為各處理不同采樣時(shí)間同位素值的加權(quán)平均值，由公式（5）計(jì)算。下同

The weighted average of18O,15Nbulkand SP were calculated by equation (5). The same as below

同列中小寫字母表示單因素方差分析（One-Way ANOVA）顯著性＜0.05。*表示雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）顯著性＜0.05

The values followed by different little letters in the same column indicate the significant differences between treatments at＜0.05 level using One-Way ANOVA. * indicate the significant differences between treatments at＜0.05 level using Two-Way ANOVA

2.2 N2O同位素值的日變化

不同處理土壤N2O同位素特征值不同（圖2）。添加根系分必物處理的18O變化基本一致，穩(wěn)定在23.43‰—25.90‰；而對照則在20.69‰—22.13‰。3種不同根系分泌物處理N2O的15Nbulk值不同，葡萄糖處理組15Nbulk值最高，變化范圍分別是：-15.22‰— 13.55 ‰（低濃度）和-14.82‰—-10.70‰（高濃度）。低濃度絲氨酸處理15Nbulk值的范圍是-26.56‰— 22.07‰，低于高濃度絲氨酸處理（-22.21‰— -16.66‰）。兩濃度草酸處理15Nbulk值差異較小，低、高濃度的變化范圍分別是-21.89‰—-15.27‰和-23.97‰—-16.75‰。3種根系分泌物濃度越高，SP值越低，低濃度草酸處理SP值從16.27‰增加至17.65‰，高濃度草酸處理SP值從16.69‰降至12.67‰；兩濃度的絲氨酸處理SP值逐漸升高，低濃度絲氨酸和高濃度絲氨酸處理變化范圍是：11.64‰—18.50‰和11.45‰—14.83‰；兩濃度葡萄糖處理SP值先升高后降低，極值分別出現(xiàn)在添加葡萄糖后的第8小時(shí)（18.79‰）和第12小時(shí)（17.26‰）。

雙因素方差分析顯示，N2O的15Nbulk受添加根系分泌物成分的影響（＜0.05），其中葡萄糖處理15Nbulk值最高（（-13.86±1.11）‰）。SP值受添加根系分泌物濃度的影響（＜0.05），濃度越高，SP值越低。單因素方差分析顯示添加根系分泌物處理N2O的18O值顯著高于對照（＜0.05），但不同組分處理間無差異；添加葡萄糖和絲氨酸的不同濃度間N2O的SP值均無明顯差異；添加草酸后土壤N2O的SP值，低濃度處理組顯著高于高濃度處理組（＜0.05）。

圖2 添加不同根系分泌物后N2O同位素特征值(δ18O, δ15Nbulk, SP)隨時(shí)間的變化

2.3 不同處理反硝化作用對N2O排放的貢獻(xiàn)

通過二元混合模型（公式（6），（7））計(jì)算各處理反硝化作用和硝化作用對土壤N2O排放的相對貢獻(xiàn)率如圖3所示?？瞻讓φ仗幚?、低濃度草酸、高濃度草酸、低濃度絲氨酸、高濃度絲氨酸、低濃度葡萄糖、高濃度葡萄糖處理反硝化作用的貢獻(xiàn)分別是：60%、48%、60%、52%、57%、51%、54%。添加草酸、絲氨酸、葡萄糖的濃度越高，反硝化作用越強(qiáng)。

2.4 各時(shí)刻N(yùn)2O排放速率和同位素特征值的校正系數(shù)

N2O排放速率和同位素特征值隨時(shí)間有一定的變化，添加根系分泌物后各時(shí)刻的檢測值和日平均值的校正系數(shù)如圖4所示。不同指標(biāo)的校正系數(shù)的波動(dòng)范圍不同，N2O排放速率的校正系數(shù)波動(dòng)較大（0.49—8.46），同位素值的校正系數(shù)波動(dòng)較?。?.79—1.87），其中各指標(biāo)前8 h校正系數(shù)的波動(dòng)較大，后逐漸減小。N2O排放速率的校正系數(shù)為1時(shí)的點(diǎn)在添加根系分泌物后的第16 h；N2O的18O值24 h內(nèi)比較穩(wěn)定，各處理校正系數(shù)穩(wěn)定在1附近；N2O的15Nbulk值的校正系數(shù)呈先增高后降低的趨勢，校正系數(shù)為1的點(diǎn)出現(xiàn)在添加根系分泌物后的第2—8小時(shí)和第16—20小時(shí)；SP值的校正系數(shù)為1的點(diǎn)出現(xiàn)在添加根系分泌物后的第16—20小時(shí)。

圖3 不同處理反硝化作用-硝化作用對N2O排放的貢獻(xiàn)

圖4 添加根系分泌物后各時(shí)刻N(yùn)2O排放速率，穩(wěn)定同位素值（δ18O, δ15Nbulk,SP）的校正系數(shù)

3 討論

3.1 根系分泌物組分和濃度對N2O排放量及其同位素特征值的影響

本研究發(fā)現(xiàn)添加根系分泌物處理土壤N2O排放量高于對照，說明根系分泌物的添加會(huì)促進(jìn)土壤N2O的排放，這和以往研究結(jié)果一致[46-47]。植物根系分泌物使植物通過光合作用固定的碳外流[48]，并以有機(jī)碳的形式釋放到土壤中。微生物從根系分泌物中獲取能量，使土壤酶數(shù)量增大，活性增強(qiáng)，導(dǎo)致N2O排放量的增加[49]。植物根系分泌物也可作為碳源改變微生物細(xì)胞內(nèi)N2O產(chǎn)生過程的電子傳遞途徑[50]，并促進(jìn)N2O的產(chǎn)生。微生物對不同根系分泌物的響應(yīng)機(jī)制不同，從而導(dǎo)致N2O產(chǎn)生路徑也會(huì)有差異，進(jìn)而造成N2O排放量的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)添加3種根系分泌物處理間土壤N2O的18O值無明顯差異，且均顯著高于對照（＜0.05）。還原為N2O的反硝化過程（→→NO→ N2O）可看作O逐漸去除的過程，16O比18O更容易斷裂使得產(chǎn)物N2O中富集18O從而產(chǎn)生同位素分餾[38]；同時(shí)，N2O還原（N2O→N2）過程也會(huì)導(dǎo)致剩余N2O的18O值升高[51-52]。而在還原過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可能會(huì)與環(huán)境中的H2O發(fā)生O交換，從而減弱在還原過程中發(fā)生的分餾效應(yīng)[38]。以上反硝化過程中的每一個(gè)還原步驟均是在不同酶的催化下發(fā)生，且導(dǎo)致不同的O同位素分餾[53]。因此根系分泌物處理組土壤N2O的18O值高于對照組可能是由于根系分泌物的添加促進(jìn)了反硝化作用的進(jìn)行，使反硝化還原酶活性改變所致；且3種根系分泌物可能共同作用了某一種對O同位素分餾起關(guān)鍵作用的酶而導(dǎo)致處理間N2O的18O值無差異。另外，添加3種根系分泌物可能造成了不同程度的N2O向N2的還原。

各根系分泌物處理N2O的15Nbulk值不同，15Nbulk值受根系分泌物組分的影響。在肥料充足的土壤條件下，N2O的15Nbulk值的升高和降低是由多種原因造成的，同位素的分餾可能是重要的原因。硝化作用的產(chǎn)物可作為反硝化作用的底物，根據(jù)同位素分餾原理，微生物優(yōu)先利用輕同位素而導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生重同位素貧化[54]使由反硝化過程產(chǎn)生的N2O的15Nbulk值降低；其次，N2O還原可能對15Nbulk值產(chǎn)生重要影響，N2O還原過程中14N-O鍵比15N-O鍵更容易斷裂，導(dǎo)致剩余N2O的15Nbulk值升高；所以添加根系分泌物通過促進(jìn)反硝化過程和N2O還原可能會(huì)導(dǎo)致N2O的15Nbulk值升高[30]。又因?yàn)橥寥乐械牟煌⑸镞^程導(dǎo)致的N同位素分餾不同[55]，這使得不同根系分泌物處理的土壤N2O的15Nbulk值有差異。由于葡萄糖會(huì)促進(jìn)N2O還原過程，該理論已在本課題組其他研究中得到驗(yàn)證[56]。此外，Speir等[57]通過15N標(biāo)記肥料也發(fā)現(xiàn)，葡萄糖為易有效碳，而易有效碳的添加會(huì)促進(jìn)反硝化過程進(jìn)行完全，促進(jìn)N2O向N2的還原過程，這可能是葡萄糖處理組N2O的15Nbulk值顯著高于對照的原因（＜0.05）。

SP值表征的是直線型分子N2O（N-N-O）的分子內(nèi)15N的位置嗜好性差異，該值和微生物過程有關(guān)，是一個(gè)被國際認(rèn)可的N2O溯源研究工具[35]。本研究發(fā)現(xiàn)同一根系分泌物組分作用下，SP值隨根系分泌物濃度的升高而降低。由于純細(xì)菌培養(yǎng)下硝化作用下產(chǎn)生的N2O的SP值為33‰[38-39]，反硝化作用下產(chǎn)生的N2O的SP值為0‰[40-41]。本研究所有處理SP值介于兩者之間則說明產(chǎn)生的N2O來源于硝化作用和反硝化作用的共同作用。根據(jù)硝化和反硝化的二元混合模型可知SP值的升高和降低分別代表土壤微生物過程趨于硝化作用方向和反硝化作用進(jìn)行，SP值越低，則反硝化作用越強(qiáng)。根系分泌物的添加為土壤提供碳源，從而促進(jìn)了異養(yǎng)微生物作用下的反硝化過程。在適宜范圍內(nèi)，反硝化作用隨著土壤碳源濃度的升高而增強(qiáng)，則產(chǎn)生的N2O的SP值也會(huì)因此而降低。

3.2 基于N2O排放速率及同位素特征值確定最佳取樣時(shí)間

在采取手動(dòng)N2O氣體觀測中，通常采用1次的檢測結(jié)果而作為1日甚至多日的平均情況，所以采樣時(shí)間的選擇尤為重要。根據(jù)研究需要，基于不同指標(biāo)的取樣時(shí)間不同，N2O排放速率、N2O的15Nbulk及SP值的最佳取樣時(shí)間分別為添加根系分泌物后的第12—16 h、4—8 h或16—20 h和16 h。由于N2O的18O值隨著培養(yǎng)時(shí)間無明顯變化，因此，取樣時(shí)間對N2O的18O值的影響不大。綜合N2O的排放速率和各穩(wěn)定同位素值的取樣時(shí)間，選擇添加根系分泌物后的第16 h為最佳取樣時(shí)間，從而可以對各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，更有利于量化不同微生物過程對土壤N2O排放的貢獻(xiàn)率。對各處理最佳取樣時(shí)間下得到的各個(gè)指標(biāo)的結(jié)果分別與日平均值做相關(guān)分析顯示（圖5）。N2O排放速率：2=0.93（＜0.001），N2O的18O值：2=0.71（＜0.001），N2O的15Nbulk值：2=0.91（＜0.05），SP值：2=0.91（＜0.001）。因此，確定不同處理組的最佳取樣時(shí)間是添加根系分泌物后的第16小時(shí)。此外，該時(shí)刻同位素值相對穩(wěn)定，說明土壤內(nèi)微生物過程穩(wěn)定，利于分析N2O產(chǎn)生的微生物過程，因此結(jié)果最具代表性。

圖5 最佳取樣時(shí)間N2O排放速率、穩(wěn)定同位素值（δ18O, δ15Nbulk, SP）和日平均值的比較

3.3 研究展望

鑒于穩(wěn)定同位素技術(shù)在區(qū)分N2O產(chǎn)生的微生物過程中存在優(yōu)勢，未來將繼續(xù)利用同位素技術(shù)圍繞不同根系分泌物組分及其組合作用下對土壤N2O的貢獻(xiàn)規(guī)律及其產(chǎn)生的多種微生物途徑進(jìn)行研究。由于N2O還原對同位素值的影響較大，且促進(jìn)N2O還原為N2是減少農(nóng)業(yè)土壤N2O排放的努力方向，所以未來研究將N2O還原納入考慮，同時(shí)引入國際穩(wěn)定同位素先進(jìn)技術(shù)和方法，如15Nbulk-18O模型和15Nbulk-SP模型，通過對反應(yīng)底物濃度、底物同位素和前體同位素圖譜的綜合分析，進(jìn)一步闡明植物根系分泌物對土壤N2O產(chǎn)生的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

通過外源添加根系分泌物3種主要組分，研究其對N2O排放高峰期的排放速率和穩(wěn)定同位素特征值的影響。在施加NH+ 4的土壤中添加草酸、絲氨酸、葡萄糖促進(jìn)土壤N2O的排放，高濃度組處理葡萄糖的促進(jìn)效果最強(qiáng)，而低濃度組處理草酸的促進(jìn)效果最強(qiáng)；根系分泌物作用下土壤排放N2O的18O的值升高；根系分泌物不同組分作用下N2O的15Nbulk值不同，葡萄糖的添加使15Nbulk值顯著升高；各處理N2O的SP值的范圍為13.13‰—15.03‰，根系分泌物濃度越高SP值越低；反硝化作用對N2O的貢獻(xiàn)越強(qiáng)。通過對所測指標(biāo)（N2O排放速率、15Nbulk、18O和SP值）的校正系數(shù)和回歸分析顯示添加根系分泌物后的最佳取樣時(shí)間為添加根系分泌物后的第16小時(shí)。

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Effects of Different Root Exudates on Soil N2O Emissions and Isotopic Signature

ZHUANG Shan1, LIN Wei1, DING JunJun1, ZHENG Qian1, KOU XinYue1, LI QiaoZhen1, LI YuZhong1,2

(1Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Dryland Farming Agriculture, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081;2Environmental Stable Isotope Laboratory, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【】The aim of this study was to investigate the effects of the main plant root exudates (organic acids, amino acids, sugars) on N2O emission and its microbial processes, so as to provide a support for selecting suitable plants to control soil N2O emissions. 【】 Three main components of root exudates, including oxalic acid, serine and glucose, were added in the soil, and two levels of concentration were set for each component: low concentration (150 μg C·d-1) and high concentration (300 μg C·d-1). There were totally 7 treatments with a control treatment treated with distilled water, and all treatments were incubated in 120 mL glass bottles in incubator. The gas samples were sampled 7 times within 24 hours after 2-hour incubation each time. After sampling, the N2O emission rate, daily cumulative emission and isotope signatures (15Nbulk,18O and SP (intramolecular15N site preference,15Nα-15Nβ)) were measured, then the optimal sampling time was determined according to their daily variation rules. 【】 The N2O emission rate of soils increased gradually after adding three components of root exudates, which were higher than the control treatment. The cumulative emission of N2O in the high concentration treatment was: Glucose treatments ((3.2±1.3) mg·kg-1·d-1)＞Serine treatments ((2.6±0.5) mg·kg-1·d-1)＞Oxalic acid treatments((1.4±0.2) mg·kg-1·d-1), low concentration treatment: Oxalic acid ((2.7±1.3) mg·kg-1·d-1)＞Serine ((1.8±0.4) mg·kg-1·d-1)＞Glucose ((1.6±0.8) mg·kg-1·d-1); the values of18O of N2O were not different among different root exudate treatments and were stable at 24.1‰-25.6‰, but significantly higher than the control treatment ((20.1±1.5) ‰);the15Nbulkvalue of N2O was related to the component of root exudates added, which was (-20.06±2.22) ‰ of oxalic acid treatment, (-22.33±1.10) ‰ of serine treatment, (-13.86±1.11) ‰ treated of glucose treatment, and (-23.14±3.72) ‰ of the control treatment. The SP value of N2O of each treatment ranged from 13.13‰ to 15.03‰, and the higher the root exudate concentration, the lower the SP value; after a comprehensive analysis of the correction coefficients of four indexes (N2O emission rate, the value of15Nbulk,18O and SP) at each sampling time and their daily mean values of 7 treatments, the correction coefficients of all treatments were closest to 1 at the 16th hour after the addition of root exudates.【】 In the soil environment with NH+ 4- 300 mg N·kg-1, the root exudates promoted N2O emission and the N2O emission rate increased gradually during the culture time (24 hours). The promotion effect of glucose in high concentration group was the strongest, while that of oxalic acid in low concentration group was the strongest. Compared with thecontrol treatment, the addition of root exudates significantly increased the18O value of N2O; the addition of glucose significantly increased the15Nbulkvalue of N2O. The higher the concentration of root exudates, the stronger the contribution of denitrification to N2O was detected.

root exudates; nitrification; denitrification; N2O; isotopic signature

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.013

2019-08-02；

2019-11-06

國家自然科學(xué)基金（41473004，41701308）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0201702）

莊姍，Tel：18519190629；E-mail：489300802@qq.com。通信作者李玉中，Tel：18810871629；E-mail：liyuzhong@caas.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）