基于WNT/β-catenin信號通路研究DMBT1調控慢性腎小球腎炎發(fā)生發(fā)展的作用機制

盧作奎 許為佳 史秀巖

442000 十堰，湖北省十堰市太和醫(yī)院腎內科

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是慢性腎臟病(CKD)的主要組成部分，也是終末期腎病最常見的病因。近年來，CGN發(fā)病率和死亡率呈不斷上升的趨勢；CGN的發(fā)生不僅給病人帶來了極大的痛苦，同時也帶來了巨大的社會負擔。CGN的特點是慢性炎癥、免疫異常、血管重塑、氧化應激、腎功能喪失、腎小球和腎小管間質瘢痕口等[1-2]。其發(fā)病的確切機制尚不清楚，有少數(shù)CGN是由急性腎炎發(fā)展所致，約占15～20%。大多數(shù)CGN由各種腎小球疾病發(fā)展而來，表現(xiàn)為慢性起病。

DMBT1是一種分子量為340 kDa的糖蛋白，包含14個半胱氨酸受體結構域重復序列(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)，2個C1r/C1s-Uegf-BMp1結構域和一個羧基末端透明帶結構域[3-4]。DMBT1由已知的介導蛋白-蛋白相互作用的氨基酸序列組成，其功能是作為革蘭氏陽性和陰性細菌的模式識別分子。有報道指出，DMBT1基因表達下調參與多種髓母細胞瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[5]。另有報道顯示DMBT1在正常胃粘膜和胃腫瘤中的異常表達，作為腫瘤相關性基因參與腫瘤調控[6]。最近的研究表明：DMBT1參與炎癥和組織纖維化過程中免疫反應的調節(jié)，與慢性炎癥、組織纖維化異常等相關[7]。但目前尚無DMBT1在CGN中的作用研究。因此，本文通過研究DMBT1在CGN組織的相對表達和甲基化，及DMBT1對人腎小球足細胞(human glomerular podocyte，HPC)遷移的影響，以揭示其在CGN中的作用，為CGN的治療尋找相應的靶點。

資料與方法

一、實驗試劑與研究對象

1.主要試劑 HPC細胞購于上海生科所細胞庫。胰蛋白酶、胎牛血清和1640培養(yǎng)液等購買于美國CST公司；本課題中引物由深圳華大基因設計并合成，本研究中引物見表1。DNA提取試劑盒套裝購買于美國Invitrogen公司，RNA逆轉錄試劑盒和實時熒光半定量PCR購買于上海碧云天實驗公司；組織蛋白提取試劑盒購買于美國賽默飛生物科技公司。本課題中大型儀器和設備主要包括恒溫細胞孵育箱、生物細胞安全柜、實時熒光定量PCR儀和蛋白電泳凝膠成像儀等，由太和醫(yī)院公共實驗平臺提供。

2.研究對象 選取十堰市太和醫(yī)院2015年1月至2018年12月收治的86例CGN患者。CGN的診斷參考2003年國際腎臟病學會和腎臟病理學會聯(lián)合制定的國際標準及已有的文獻報告[8]。納入標準：(1)存在3個月及以上的腎臟功能或結構異常；(2)存在腎臟病理學檢查異常和/或腎臟損傷；(3)存在3個月及以上的腎小球濾過率低于60 mL·min-1·(1.73 m2)-1，有或無腎結構、功能損傷[8]。86例CGN患者中，男性患者54例，女性患者32例，年齡11～49歲，中位年齡24.4歲；病程：4個月～6年，平均病程(1.16±0.23)年。納入患者的主要病理分型包括：系膜增生性腎小球腎炎、系膜毛細血管性腎小球腎炎、膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等。另外選取我院30例行腎癌手術切除的癌旁正常腎組織(距離腫瘤組織約5 cm)患者作為正常腎臟對照組，其中男性8例，女性12例，平均年齡(62.8±5.6)歲。

二、方法

1.DNA和RNA提取 使用DNA zol套裝和QIAamp DNA套裝提取腎組織中DNA，提取方法參考試劑盒中的說明書和已有的文獻報道[9]。RNA提取方法主要包括：(1)勻漿處理(組織勻漿或細胞消化離心)；(2)將勻漿樣品在室溫(15～30 ℃)放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離；(3)加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，得到水相液；(4)異丙醇沉淀水相中的RNA；(5)離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，75%乙醇洗滌RNA沉淀，RNA沉淀干燥后加入無RNase水溶解。提取的RNA逆轉錄為cDNA，實驗方法參考試劑盒中的說明書和已有的文獻報道[9]。處理好的cDNA和DNA保存于-80 ℃冰箱保存。

2.甲基化PCR檢測 亞硫酸氫鹽修飾DNA和甲基化特異性PCR(MSP)方法同已有的文獻報道[10]。MSP分析顯示，MSP引物在未亞硫酸化的DNA中沒有擴增產(chǎn)物，因此具有特異性。MSP在2%含100 bp DNA標記的瓊脂糖凝膠上實驗；加入AmpliTaq-Gold DNA Polymerase酶，退火溫度為60 ℃或55 ℃，反應周期：40 cycles。甲基化和非甲基化人類DNA分別用作陽性和陰性對照。甲基化特異性引物見表1。

表1 實驗相關引物

3.半定量PCR檢測 實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)的實驗方法和統(tǒng)計方法同參考文獻[11]，通過qRT-PCR檢測DMBT1 mRNA在正常腎上皮組織、CGN患者腎組織中的相對表達；及DMBT1對WNT信號通路相關因子的影響。qRT-PCR上機總反應體系如下：95 °C 5 min；95 °C 30 s；55 °C 30 s；72 °C 30 s；25 °C 10 min。其中內參循環(huán)23 cycle，目的循環(huán)32 cycle。所有實驗獨立重復三次。

4.細胞轉染 HPC細胞的培養(yǎng)和方法同已有的文獻報道[12]。將活性狀態(tài)下HPC種植于六孔板，當細胞密度生長至80%～90%時進行細胞轉染；用脂質體Lipofectamine-2000(invitrogen)進行轉染，分別轉染對照質粒NEG和目前質粒DMBT1(購買于廣州復能基因)。轉染后加入細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入G418進行細胞篩選二周獲得穩(wěn)定表達的細胞系，進行后續(xù)功能實驗。

5.細胞劃痕實驗 細胞劃痕實驗用于檢測DMBT1對細胞遷移的影響。將穩(wěn)定轉染的DMBT1轉染組和對照組細胞平鋪種植于六孔板中(5×105細胞/孔)，加入細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度至90%時進行后續(xù)實驗。細胞層用無菌的P-20移液管尖刮傷，然后用PBS沖洗兩次，小心去除細胞碎片，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每12小時于100倍顯微鏡下拍照，觀察細胞的相對遷移率。所有實驗獨立重復三次。

6.免疫蛋白印跡實驗 免疫蛋白印跡(western blot)實驗方法的步驟和統(tǒng)計方法同參考文獻[13]，當DMBT1質?；蚩蛰d體對照進行轉染48 h后，從轉染細胞中提取蛋白質。然后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離細胞裂解液，然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在PBST中用5%的牛奶封閉1 h后，用DMBT1、β-catenin、active-β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、E-canherin、N-cadherin、Vimentin及SALL1等相關一抗(abcam)4 ℃孵育過夜。第二天常溫下復溫0.5 h后，PBST液洗膜3次，每次10 min；加入二抗封閉液室溫下孵育1～2 h，使用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)顯示免疫印跡；GAPDH用作對照。所有實驗獨立重復三次。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、DMBT1 mRNA和蛋白在CGN組織中表達情況

采用免疫蛋白印跡實驗分析DMBT1蛋白在CGN、正常腎上皮組織中相對表達；結果顯示：與正常腎上皮組織相比，DMBT1蛋白在CGN組織中表達下調(P<0.01)(圖1A)；進一步分析DMBT1蛋白的表達與CGN中臨床病理特征的相關性，結果顯示DMBT1蛋白表達下調程度與CGN病理類型(P=0.214)、腎功能(P=0.451)及腎纖維化程度(P=0.562)無明顯相關性。同時qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，與正常腎上皮細胞相比，DMBT1 mRNA在CGN組織表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1B)。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)DMBT1定位于腎小球細胞胞質中(圖1C)，與以往文獻結果相一致[5-6]。以上結果提示DMBT1的表達下調可能作為CGN相關基因參與腎病的發(fā)生發(fā)展。

注：CGN為慢性腎小球腎炎，Normal為正常腎上皮組織圖1 DMBT1蛋白及mRNA在不同腎組織中的表達情況 A.DMBT1蛋白在不同腎組織中的表達情況，B.DMBT1 mRNA在不同腎組織中的表達情況，C.DMBT1在腎組織中的定位情況

二、DMBT1在CGN組織中甲基化表達情況

啟動子異常甲基化是導致多種抑癌基因表達沉默的重要機制，文獻顯示DMBT1啟動子含有多個甲基島(CpG島)序列[14]，提示DMBT1可能作為重要的甲基化基因參與腫瘤的進程。本研究中甲基化PCR結果顯示：在絕大多數(shù)CGN患者中均發(fā)生DMBT1啟動子甲基化(甲基化率為83.7%)，但在正常腎組織中卻沒有甲基化(圖2)。因此，我們推測DMBT1基因甲基化可能參與CGN的進程。

注：M為甲基化，U為非甲基化，ddH2O為陰性對照圖2 DMBT1在不同腎組織中甲基化表達情況

三、DMBT1對人腎小球足細胞遷移的影響

為進一步探討DMBT1對HPC細胞遷移的影響，我們進行了細胞劃痕實驗。結果顯示：與對照組相比，DMBT1轉染的HPC細胞在48 h后傷口的愈合能力明顯延遲，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3A、3B)。體外細胞培養(yǎng)實驗顯示，過表達DMBT1后，腎小球足細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖3C)。因此我們推測DMBT1可能作為腎病相關的功能性基因參與CGN的進程。

圖3 DMBT1對腎小球足細胞遷移的影響 A.細胞劃痕實驗，B.DMBT1轉染組與對照組細胞遷移率比較折線圖，C.體外細胞培養(yǎng)實驗

四、DMBT1對WNT/β-catenin信號通路的作用

分別取DMBT1轉染組與對照組細胞，提取總蛋白，采用免疫蛋白印跡法檢測WNT/β-catenin以及下游靶基因、上皮-間質轉化相關分子的表達水平。結果顯示，DMBT1轉染后active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin和Snail1的蛋白表達下調(P<0.01)；E-cadherin的蛋白表達水平上調(P<0.01)。(圖4)

注：與對照組比較，aP<0.01圖4 DMBT1對WNT/β-catenin信號通路的作用 A.免疫蛋白印跡實驗，B.DMBT1轉染組與對照組細胞active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Snail1的蛋白表達水平比較

討 論

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學機制，通過甲基化修飾使基因表達沉默[11]；DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點的胞嘧啶殘基上，DNA甲基化是維持組織/細胞中基因表達狀態(tài)特異性的重要機制[11]。在病理學的機制中，異常的DNA甲基化和隨之出現(xiàn)基因異常表達可能與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關，包括癌癥、心血管疾病、代謝紊亂(肥胖和糖尿病)和腎臟疾病[15]。在過去的幾年中，對CKD患者進行的研究表明：全身DNA甲基化模式與腎功能下降相關[16]。最近一項關于社區(qū)動脈粥樣硬化風險和心臟疾病患者全血DNA甲基化的表觀全基因組關聯(lián)研究顯示，特定CpG位點(如JAZF1中的CG23597162、PTPN6/PHB2中的CG19942083、ZNF788/ZNF20中的CG17944885)的DNA甲基化水平與腎小球濾過率降低、發(fā)生CKD或腎功能損害之間存在關聯(lián)[17-18]。

上皮細胞-間充質轉化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移和多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用，其主要的特征有細胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達的減少、細胞角蛋白轉化為波形蛋白為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間充質細胞的特征等。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型。EMT是腎臟纖維化的重要環(huán)節(jié)，而間質纖維化是所有CKD終末期的表現(xiàn)，并最終導致腎功能衰竭[19]。WNT/β-catenin信號通過誘導其靶基因可影響不同生物學行為，與調節(jié)器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生密切相關；WNT/β-catenin在腎損傷和纖維化中有部分特異性的靶點，如Snail1等。Snail1是一個關鍵的轉錄因子，可影響EMT進程[20]；Snail1轉錄抑制上皮性鈣黏附蛋白的表達，并導致上皮細胞-細胞黏附的破壞，Snail1和β-catenin活化蛋白均上調，β-catenin的激活在體外誘導了腎小管上皮細胞和腎小球足細胞中的Snail1表達，在纖維化疾病中占主導地位。因此，研究CGN患者DNA甲基化及EMT相關調節(jié)基因對揭示CGN的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。

本實驗發(fā)現(xiàn)，DMBT1 mRNA和蛋白在CGN患者中表達明顯下調，DMBT1蛋白表達下調程度與CGN病理類型、腎功能及腎纖維化程度無明顯相關性；甲基化PCR分析進一步發(fā)現(xiàn)，與正常腎組織相比，DMBT1在CGN腎組織中甲基化程度明顯升高；提示DMBT1可能作為重要甲基化基因影響CGN的進程。腎小管間質纖維化是影響CGN發(fā)展和預后的重要因素，腎小管EMT是腎小管間質纖維化的重要機制。當EMT發(fā)生時，腎小管上皮細胞失去了上皮細胞的特性，并促進腎間質纖維化的進展[21-22]。而本研究通過細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，DMBT1的表達能影響細胞遷移，提示DMBT1基因甲基化丟失可能與CGN的間質纖維化密切相關。另有文獻顯示，WNT/β-catenin信號通路及下游的分子靶點與CKD的發(fā)生發(fā)展密切相關[19-20]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在腎小球足細胞HPC中，過表達DMBT1基因后，active-β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Vimentin、N-cadherin和Snail1的蛋白表達水平降低，E-cadherin的蛋白表達水平升高；因此，我們推測DMBT1可能通過調控WNT/β-catenin信號通路，抑制上皮間充質轉變，從而影響CGN的進程。

本研究證實了DMBT1在CGN中的表達及調控，有助于我們進一步的了解CGN的發(fā)病及發(fā)展的機制，同時使我們了解了腎小球腎炎從蛋白尿到纖維化的分子調控機制，為CGN的治療提供了新的思路。