狼瘡腎炎患者HMGB1變化的臨床意義及其靶向激活TLR/NF-κB通路的作用研究

潘紅梅 周廣軍 馬金榮 張宏穎 郭維毅

061001 滄州，河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病科

狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)最常見(jiàn)的病變之一，也是影響SLE預(yù)后的重要因素[1-2]。LN的發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，腎臟組織中免疫復(fù)合物異常沉積、炎癥反應(yīng)異常激活與LN的腎臟病理改變密切相關(guān)，多種免疫及炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子被證實(shí)與LN的發(fā)生有關(guān)[3-4]。高遷移率族蛋白1(high mobility group protein box 1，HMGB1)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類促炎因子，Toll樣受體(toll like receptor，TLR)中的TLR2和TLR4是其受體，與HMGB1結(jié)合發(fā)生活化后引起核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活，進(jìn)而在刺激炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞活化、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌中起到重要作用[5-6]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HMGB1/TLR/NF-κB在LN模型小鼠的腎臟組織中呈過(guò)度激活的狀態(tài)[7-8]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以LN患者為對(duì)象，具體分析了HMGB1變化的臨床意義及其靶向TLR/NF-κB通路的作用。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2015年1月至2018年12月期間在滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的80例LN患者作為L(zhǎng)N組，入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合SLE診斷；(2)經(jīng)腎穿刺活檢診斷為L(zhǎng)N；(3)臨床及病理資料完整。另外納入同期就診的不合并腎損害的50例SLE患者作為單純SLE組，納入一般資料與LN患者匹配的50例體檢健康者作為對(duì)照A組，納入因外傷接受腎臟切除且一般資料與LN患者匹配的30例患者作為對(duì)照B組。LN組中男性24例、女性56例，年齡31～57歲、平均年齡(49.5±7.6)歲；對(duì)照A組中男性18例、女性32例，年齡30～58歲、平均年齡(50.2±8.1)歲；對(duì)照B組中男性12例、女性18例，年齡28～54歲、平均年齡(49.6±8.3)歲。三組間一般資料比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1.臨床信息的收集 回顧LN患者的病史資料，收集以下信息：血紅蛋白、血肌酐、血清尿素氮、eGFR、24 h尿蛋白定量、SLEDAI評(píng)分以及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、節(jié)段硬化、微血栓、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞性新月體、纖維素樣壞死、細(xì)胞核碎裂、白金耳樣改變等病理特征。

2.臨床樣本收集及保存 取LN組、單純SLE組、對(duì)照A組、對(duì)照B組的空腹肘靜脈血3 mL，靜置半小時(shí)后自然凝血，而后在離心機(jī)中以3 000轉(zhuǎn)/min的速度離心10 min，分離血清并保存在-80 ℃冰箱；取LN組患者腎穿刺的腎組織及對(duì)照B組患者手術(shù)切除的正常腎組織，各分為兩份，一份液氮冷凍半小時(shí)后保存在-80 ℃冰箱、另一份多聚甲醛固定后石蠟包埋保存。

3.酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)檢測(cè)血清HMGB1 取對(duì)照A組、B組受試者和LN組患者的血清，采用上海西唐公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒檢測(cè)血清中HMBG1的含量，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4.免疫組化檢測(cè)腎臟HMGB1、TLR2、TLR4、NF-κB 取對(duì)照B組及LN組患者石蠟包埋的腎臟組織，采用武漢博士德公司生產(chǎn)的SP法二步法免疫組化染色試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，4 ℃孵育HMGB1、TLR2、TLR4、NF-κB的一抗過(guò)夜，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、在顯微鏡下觀察，取高倍鏡下的5個(gè)隨機(jī)視野、計(jì)算平均光密度值，并按下列方法判斷HMBG1的陽(yáng)性或陰性染色：細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%定義為HMBG1陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥5%定義為陽(yáng)性表達(dá)。

5.HMGB1靶向TLR2、TLR4的免疫共沉淀檢測(cè) 取對(duì)照B組及LN組患者液氮冷凍的腎臟組織，加入RIPA裂解液對(duì)組織進(jìn)行裂解、提取蛋白。取30 μg全蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照、直接進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)；剩余蛋白樣本，每30 μg加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖原液，而后分別加入HMGB1、TLR2、TLR4的IgG一抗或陰性對(duì)照的IgG，4 ℃緩慢翻轉(zhuǎn)孵育、使抗原抗體結(jié)合過(guò)夜。次日，加入瓊脂糖珠30 μL、翻轉(zhuǎn)孵育6 h，捕捉抗原抗體復(fù)合物；收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，加入上樣緩沖液后煮沸5 min，12 000轉(zhuǎn)/分離心10 min、收集上層澄清樣本，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)的步驟包括電泳、電轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL顯影，得到蛋白條帶后分析HMGB1與TLR2、TLR4的靶向結(jié)合作用。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、LN患者血清及腎臟中HMGB1的變化

LN組患者血清中HMGB1的含量明顯高于對(duì)照A組及對(duì)照B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LN組患者腎臟中HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)率及平均光密度值均明顯高于對(duì)照B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表1、圖1)

二、不同HMGB1表達(dá)的LN患者腎臟病變的比較

腎臟中HMGB1陽(yáng)性表達(dá)的LN患者的eGFR水平、C3水平明顯低于HMGB1陰性表達(dá)的LN患者(P<0.05)；24 h尿蛋白定量、SLEDAI評(píng)分明顯高于HMGB1陰性表達(dá)的LN患者(P<0.05)；dsDNA陽(yáng)性、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、節(jié)段硬化、微血栓、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞性新月體、纖維素樣壞死、細(xì)胞核碎裂、白金耳樣改變的比例均高于HMGB1陰性表達(dá)的LN患者，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；C4、血紅蛋白、肌酐、尿素氮的水平與HMGB1陰性表達(dá)的LN患者比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(表2)

表1 各組患者血清及腎臟中HMGB1的比較

注：LN組與對(duì)照A組比較，aP<0.05；LN組與對(duì)照B組比較，bP<0.05；LN組與單純SLE組比較，cP<0.05

圖1 對(duì)照B組及LN組腎臟的HMGB1免疫組化染色圖(×400)

表2 不同HMGB1表達(dá)的LN患者腎臟病變的比較

三、LN患者腎臟中TLR2、TLR4、NF-κB的變化

LN組患者腎臟中TLR2、TLR4、NF-κB的平均光密度值均明顯高于對(duì)照B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表3、圖2)

表3 與LN組腎臟中TLR2、TLR4、NF-κB的比較

圖2 對(duì)照B組及LN組腎臟的HMGB1免疫組化染色圖(×400)

四、免疫共沉淀驗(yàn)證HMGB1對(duì)TLR2、TLR4的靶向結(jié)合

經(jīng)免疫共沉淀驗(yàn)證，加入HMGB1的IgG抗體后能夠使TLR2、TLR4發(fā)生沉淀，免疫印跡中TLR2、TLR4均呈陽(yáng)性表達(dá)；加入TLR2或TLR4的IgG抗體后能夠使HMGB1發(fā)生沉淀，免疫印跡中HMGB1呈陽(yáng)性表達(dá)。(圖3)

圖3 HMGB1與TLR2、TLR4靶向結(jié)合的免疫共沉淀驗(yàn)證

討 論

腎臟是SLE最常見(jiàn)的受累靶器官，LN也是SLE患者常見(jiàn)的死亡原因之一。近年來(lái)關(guān)于LN病理特征的研究證實(shí)，其病理實(shí)質(zhì)是免疫復(fù)合物性腎小球腎炎，免疫復(fù)合物的異常沉積、炎癥反應(yīng)的異常激活能夠引起腎小球系膜增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、間質(zhì)纖維化等腎臟病理?yè)p害的發(fā)生[9-11]，但目前調(diào)控LN病程中炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的機(jī)制仍未完全闡明。HMBG1是新發(fā)現(xiàn)的一類具有促炎活性的細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等分泌產(chǎn)生，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后能夠引起免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞發(fā)生活化并向腎臟組織遷移、浸潤(rùn)，進(jìn)而在腎臟內(nèi)促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)大量釋放并引起炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大、刺激多種免疫細(xì)胞分化并引起免疫應(yīng)答紊亂，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步出現(xiàn)腎臟的病理?yè)p害[12-13]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于HMGB1與LN發(fā)病的多項(xiàng)研究證實(shí)，LN患者血清中HMBG1的含量及腎臟中HMGB1的表達(dá)量均明顯增加[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)LN患者體內(nèi)HMBG1的變化進(jìn)行了驗(yàn)證并得到了與前述研究一致的結(jié)果，說(shuō)明HMGB1分泌及表達(dá)增多與LN的發(fā)生有關(guān)，HMGB1分泌增多能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞發(fā)生活化并向腎臟浸潤(rùn)，在腎臟內(nèi)大量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞能夠進(jìn)一步表達(dá)和分泌HMGB1并加重炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的紊亂。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析HMGB1表達(dá)改變與腎臟病變的關(guān)系，以此來(lái)反映HMGB1在腎臟病理?yè)p害中的作用。腎臟中HMGB1陽(yáng)性表達(dá)的LN患者的eGFR水平明顯降低，24 h尿蛋白定量、SLEDAI評(píng)分明顯升高，說(shuō)明HMGB1的高表達(dá)能夠加劇LN的病理?yè)p害、引起腎功能惡化及尿蛋白排泄增多；腎臟中HMGB1陽(yáng)性表達(dá)的間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、節(jié)段硬化、微血栓、間質(zhì)纖維化等病理改變均加重，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與納入患者的樣本量較少、無(wú)法得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分析結(jié)果，但仍可說(shuō)明HMGB1的高表達(dá)能夠使LN的多種病理改變加重，今后進(jìn)一步增加樣本量有助于得出更為確切的數(shù)據(jù)。

細(xì)胞膜上識(shí)別HMGB1的受體包括RAGE、TLR2、TLR4等，其中TLR2、TLR4與HMGB1結(jié)合后能夠引起下游NF-κB發(fā)生活化并向細(xì)胞核移位，進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)[16-18]。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HMGB1/TLR/NF-κB通路在LN小鼠模型的腎臟中過(guò)度激活，幾種分子的表達(dá)均明顯增多且呈正相關(guān)關(guān)系。本研究對(duì)LN患者腎臟中TLR2、TLR4、NF-κB的分析證實(shí)，TLR2、TLR4、NF-κB的平均光密度值均明顯升高，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中TLR/NF-κB通路的變化相吻合，結(jié)合HMGB1在LN腎臟中高表達(dá)的趨勢(shì)推測(cè)，高表達(dá)的HMGB1能夠刺激TLR/NF-κB通路激活并引起LN的病理改變。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了HMGB1是否直接與TLR2及TLR4結(jié)合，加入HMGB1的抗體沉淀HMGB1的同時(shí)，TLR2及TLR4也發(fā)生了沉淀；加入TLR2及TLR4的抗體沉淀TLR2及TLR4的同時(shí)，HMGB1也發(fā)生了沉淀。由此說(shuō)明HMGB1能夠直接結(jié)合TLR2及TLR4，進(jìn)而通過(guò)激活NF-κB來(lái)參與LN的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，HMGB1的高表達(dá)與LN的發(fā)生及病變的發(fā)展可能有關(guān)，靶向激活TLR/NF-κB通路是其可能的機(jī)制，在今后的研究中，一方面需進(jìn)一步增加LN患者的例數(shù)來(lái)闡明HMBG1表達(dá)改變與LN病理改變的關(guān)系，另一方面可建立LN動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證HMGB1在腎臟病理改變中的作用。