氣相色譜法測(cè)定米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量

李赫宇，王鈺，張東星，於洪建，晏仁義

（天津益倍生物科技集團(tuán)有限公司，天津300457）

米糠是大米加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，一般會(huì)產(chǎn)生約5%～8%米糠，新鮮米糠中含有米糠油約16%～22%[1]。米糠油中含有3%左右的米糠蠟，米糠蠟中含有高級(jí)脂肪烷醇和高級(jí)脂肪酸，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分析，二十八烷醇占總醇的11%～17%；三十烷醇占總醇的17%～22%[2-3]。2017年我國(guó)批準(zhǔn)米糠脂肪烷醇為新資源食品，規(guī)定其工藝為米糠蠟經(jīng)皂化、提取、過(guò)濾等工藝制成。規(guī)定主要成分二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇的含量之和為78%～88%。我國(guó)大米的產(chǎn)量和加工量占世界總量的三分之一，加工副產(chǎn)物米糠的量也驚人，我國(guó)目前在米糠的加工利用方面處在初級(jí)階段。米糠脂肪烷醇作為新資源食品使用一定程度上能拉動(dòng)米糠的綜合利用。

目前米糠脂肪烷醇的標(biāo)準(zhǔn)還不完善，導(dǎo)致目前市場(chǎng)上的對(duì)其運(yùn)用還存在一定的問(wèn)題。首先，未制定統(tǒng)一的具體的含量測(cè)定方法，一般參照GB/T 32947-2016《蜂蠟中二十八烷醇、三十烷醇的測(cè)定氣相色譜法》測(cè)定，或者自擬定的方法，方法的不一致帶來(lái)一定的混亂。其次，規(guī)定二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇的含量之和為78%～88%。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研二十八烷醇和三十烷醇的功能作用完全不同。二十八烷醇又名蒙旦醇，發(fā)現(xiàn)其能夠治療人體生殖障礙疾病，逐漸被人們所研究[4]。后來(lái)大量的研究表明二十八烷醇有抗疲勞，增強(qiáng)身體素質(zhì)（耐力，精力，體力）[5]、抗凝血作用[6]、降血脂[7-8]、升高人體基礎(chǔ)代謝率[9-11]、提高免疫力[12]、提高反應(yīng)靈敏度[13]、保護(hù)肝臟[14]，細(xì)胞保護(hù)功能[15]等作用。三十烷醇又名蜂花醇，對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，可作為一種新的天然存在的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[16]。因此，可能會(huì)存在脂肪烷醇的含量之和滿足標(biāo)準(zhǔn)，但是比例不同會(huì)導(dǎo)致功能的差異。本研究建立氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，用此來(lái)測(cè)定市場(chǎng)上不同廠家不同批號(hào)的米糠脂肪烷醇樣本，為米糠脂肪烷醇的含量測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)的提升提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；MS105DU型1/10萬(wàn)電子天平：瑞士梅特勒-托利多有限公司；島津GC-2010 plus氣相色譜儀：日本島津株式會(huì)社。

1.2 材料與試劑

米糠脂肪烷醇：市售。

二十八烷醇和三十烷醇對(duì)照品（純度99.0%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院。三苯基苯（純度99.5%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH。色譜純環(huán)己烷：天津市康科德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

毛細(xì)管色譜柱：HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為N2，流量為0.5 mL/min；分流模式，進(jìn)樣量為2 μL，分流比 50 ∶1。空氣流速：300 mL/min；氫氣流速：30 mL/min；進(jìn)樣口溫度：320℃；檢測(cè)器溫度：340℃。柱溫箱溫度程序升溫：初始溫度250℃保持1 min，以5℃/min升溫到290℃，保持15 min，再以8℃/min的速率升到300℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度：320℃；氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），溫度340℃進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)樣體積為2 μL，分流比50∶1。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)液的配置

準(zhǔn)確稱(chēng)取三苯基苯25 mg，置于50 mL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解并定容至刻度線，配成0.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。置于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置

準(zhǔn)確稱(chēng)取二十八烷醇和三十烷醇各50 mg分別置于10 mL容量瓶中，加環(huán)己烷溶解并定容，配成濃度為5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.15、0.35、0.55、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 于 2 mL 容量瓶，分別準(zhǔn)確加入0.4 mL內(nèi)標(biāo)液，用環(huán)己烷定容。配置成 375 μg/mL～3 750 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.4 樣品溶液的制備

精密稱(chēng)取樣品10 mg～30 mg，置于5 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入三苯基苯內(nèi)標(biāo)液溶液1.0 mL，60℃加熱溶解，冷卻至室溫（25℃），用環(huán)己烷定容，搖勻。

1.4 測(cè)定與計(jì)算

在所選的色譜條件下，待色譜儀穩(wěn)定后，將所配置的一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算公式計(jì)算，以Ci/Cs為橫坐標(biāo)，Ai/As為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。

式中：f為相對(duì)校正因子；Ai為待測(cè)溶液中各高級(jí)烷醇的峰面積值；As為加入內(nèi)標(biāo)物三苯基苯的峰面積值；Ci為待測(cè)組分的濃度；Cs為內(nèi)標(biāo)物的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

參照國(guó)標(biāo)GB/T 32947-2016《蜂蠟中二十八烷醇、三十烷醇的測(cè)定氣相色譜法》中的色譜條件，進(jìn)行流速、程序升溫與分流比的調(diào)整，使方法更適合于米糠烷醇提取物的測(cè)試。最終的條件如1.3.1所述。色譜圖基線較參照方法平穩(wěn)，三苯基苯、二十八烷醇和三十烷醇分離度良好，如圖1所示。GB/T 32947-2016《蜂蠟中二十八烷醇、三十烷醇的測(cè)定氣相色譜法》測(cè)定米糠脂肪烷醇的色譜圖如圖2所示，基線漂移明顯，二十八烷醇色譜峰前明顯有雜峰未分離開(kāi)。

2.2 檢測(cè)限和定量限

按1.3.1中色譜條件，將1.3.2中標(biāo)準(zhǔn)工作溶液樣品，逐級(jí)稀釋不同濃度，當(dāng)峰高比基線噪音高3倍（即S/N=3）和10倍（即S/N=10）時(shí)，以此時(shí)物質(zhì)的濃度為檢測(cè)限和定量限。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 對(duì)照品和米糠脂肪烷醇樣品的氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatograms of references and sample

圖2 參照GB/T 32947-2016分析樣本的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of sample analyzed by GB/T 32947-2016

按1.3.1中色譜條件，測(cè)試1.3.2中標(biāo)準(zhǔn)工作溶液樣品中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物在色譜檢測(cè)器上的峰面積。以峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，濃度比為橫坐標(biāo)X做標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)峰高比基線噪音高3倍（即S/N=3）和10倍（即S/N=10）時(shí)，以此時(shí)物質(zhì)的濃度為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果如表1所示。當(dāng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為100 μg/mL，各標(biāo)準(zhǔn)品在 375 μg/mL～3 750 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，二十八烷醇和三十烷醇呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2=0.999 5，說(shuō)明相關(guān)性很高。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品混合溶液，按照1.3.1中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值。記錄峰面積，分別計(jì)算二十八烷醇、三十烷醇與內(nèi)標(biāo)物三苯基苯峰面積的比值。結(jié)果顯示，二十八烷醇與三苯基苯峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.80%，三十烷醇與三苯基苯峰面積比值的RSD為1.39%，表明儀器精密度良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of references

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精確稱(chēng)取一定量的樣品，共6份，按照1.3.4中的方法制備供試品溶液，按照1.3.1中的色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果6份樣品中，二十八烷醇和三十烷醇含量的RSD分別為4.30%和1.67%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確稱(chēng)取一定量的樣品，按照1.3.4中的方法制備供試品溶液，按照1.3.1中的色譜條件分別于1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算出樣品中二十八烷醇和三十烷醇的含量。結(jié)果顯示，二十八烷醇和三十烷醇含量的RSD分別為3.98%和5.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取供試品5 mg，共6份。分別加入樣本中基本等量的二十八烷醇和三十烷醇對(duì)照品，按照1.3.4中的方法制備供試品溶液，按照1.3.1中的方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，二十八烷醇的回收率為99.41%，RSD為3.28%；三十烷醇的回收率為99.48%，RSD為3.17%，表明本試驗(yàn)所建立的方法能夠滿足米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量測(cè)定。

表2 二十八烷醇和三十烷醇加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results on the recovery rate of octacosanol and triacontanol

2.8 樣品含量測(cè)定

按上述的建立的色譜方法，進(jìn)行樣本的含量測(cè)定。每份樣本重復(fù)測(cè)定兩次，以待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)物峰面積比，通過(guò)回歸方程計(jì)算出濃度比，從而計(jì)算出試樣中待測(cè)成分的量，計(jì)算結(jié)果如表3所示。

表3 樣品中二十八烷醇和三十烷醇含量Table 3 The contents of octacosanol and triacontanol in samples %

3 討論與結(jié)論

本文建立了氣相色譜法，以三苯基苯為內(nèi)標(biāo)測(cè)定新資源食品米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量，通過(guò)分離條件的優(yōu)化和方法學(xué)考察，建立的方法可滿足米糠脂肪烷醇的質(zhì)量分析要求。分離采用HP-5 色譜柱，在 375 μg/mL～3 750 μg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.999）。

15份市場(chǎng)上收集的樣本的分析結(jié)果表明有4份樣本的含量不符合我國(guó)法規(guī)的要求（其中有3份含量略超過(guò)88%）。所分析的樣本中三十二烷醇的含量都很低（小于2%），甚至未檢測(cè)到。并且二十八烷醇和三十烷醇的對(duì)照品易得，而三十二烷醇的對(duì)照品難買(mǎi)到。從報(bào)道的功能方面考慮，多集中在二十八烷醇的生物活性方面，其他兩個(gè)烷醇的生物活性報(bào)道很少。隨著純化技術(shù)的進(jìn)步，能夠獲得高純度的二十八烷醇產(chǎn)品，比如樣本1和2中二十八烷醇含量分別高達(dá)95.20%和84.36%。并且國(guó)外的運(yùn)用中高純度的二十八烷醇比較受歡迎。因此從實(shí)際出發(fā)對(duì)米糠脂肪烷醇的標(biāo)準(zhǔn)是否可以只測(cè)試二十八烷醇和三十烷醇含量，并且規(guī)定二十八烷醇需達(dá)到某個(gè)含量，根據(jù)分析檢測(cè)的15份樣本可參考制定二十八烷醇達(dá)到50%。另外，對(duì)于規(guī)定3個(gè)烷醇含量之和不能超過(guò)88%，是否會(huì)限制新技術(shù)的運(yùn)用，不能體現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)。