牙齦卟啉單胞菌感染在肺癌中的臨床意義及預(yù)后價(jià)值

劉怡文， 原翔， 孫蔚， 孔金玉， 高社干*

(1. 河南科技大學(xué) 信息工程學(xué)院， 河南 洛陽 471023； 2. 河南科技大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院/第一附屬醫(yī)院 分子生物實(shí)驗(yàn)室/腫瘤研究所/河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 洛陽 471003)

肺癌是一種對人體生命健康威脅很大的惡性腫瘤，其5年生存率不超過15%[1]，主要分為兩大類，一類是小細(xì)胞肺癌，占20%左右；另一類是非小細(xì)胞肺癌，占80%左右，包含鱗癌、腺癌等.肺癌早期無特異性臨床表現(xiàn)，僅有一般呼吸系統(tǒng)疾病所共有的癥狀，因此診斷困難，一旦出現(xiàn)胸部疼痛、氣促、胸腔積液等臨床癥狀，病變已到晚期，預(yù)后極差[2].肺癌的病因至今尚不完全明確，其危險(xiǎn)因素主要包括：吸煙、職業(yè)和環(huán)境接觸、既往肺部慢性感染、遺傳易感性及免疫功能降低等.隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展、進(jìn)步，基因改變和環(huán)境暴露共同構(gòu)成肺癌的病因?qū)W，而感染因素是環(huán)境暴露的重要課題[3].目前已有大量研究表明，多種病原微生物均可通過長期定植于機(jī)體，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-7].

牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis, Pg)作為口腔優(yōu)勢菌，是毒力最強(qiáng)的致病菌之一[8].口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，且血供豐富，致病菌可隨血液循環(huán)輕易播散至全身.因此，口腔特殊的解剖結(jié)構(gòu)與環(huán)境賦予Pg重要的病理生理學(xué)意義，廣泛的血源性侵入可促進(jìn)Pg參與多種全身系統(tǒng)性疾病進(jìn)程[8-11].更為嚴(yán)峻的是，Pg感染與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-19].本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，Pg在食管癌患者癌組織中檢出率高達(dá) 42%，在上消化道腫瘤中呈現(xiàn)上高下低的分布狀態(tài)，且與臨床病理學(xué)特征及5 年生存期有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)[15,19].因此，Pg和食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).由于食管和氣管緊密毗鄰的位置結(jié)構(gòu)特殊，且Pg進(jìn)入細(xì)胞的過程是瞬時(shí)的，并可在細(xì)胞中長期定植，推測Pg可能通過口腔或血液定植于肺癌細(xì)胞，促進(jìn)肺癌的惡性進(jìn)展.

本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測肺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織中Pg感染情況，并分析Pg感染與肺癌患者臨床病理特征及5年生存期之間相關(guān)性，以期為改善肺癌患者的生存預(yù)后提供新的思路和參考.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月到2012年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織(距癌組織邊緣>5 cm)石蠟包埋標(biāo)本為研究對象.

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后病理診斷明確為小細(xì)胞肺癌、肺腺癌或肺鱗癌；(2)患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)治療和免疫治療；(3)治療性肺癌切除術(shù)后；(4)同時(shí)具備癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織；(5)病例資料信息全面；(6)術(shù)后隨訪時(shí)間為60個(gè)月(5年).

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理診斷非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌或肺鱗癌；(2)患者術(shù)前接受過放射治療、化學(xué)治療或免疫治療；(3)病例資料不完整.

本研究經(jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤研究所及醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(81702820)，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意入組參與研究.

1.2 主要試劑與儀器

鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin peroxidase, SP)(含過氧化物酶阻斷劑，正常山羊血清，山羊抗鼠/兔聚合物與SP)試劑盒(中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Pg兔抗人單克隆抗體(美國圣路易斯維爾口腔醫(yī)學(xué)院)，檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0)、蘇木素、中性樹膠、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(中國北京索萊寶科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)(中國北京索萊寶科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(E100+ISH500，日本尼康公司).

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測Pg感染情況

取常規(guī)石蠟包埋的肺癌組織及癌旁肺組織標(biāo)本切片，片厚3 μm；于60 ℃溶蠟1.5 h，二甲苯脫蠟3次,每次10 min，體積分?jǐn)?shù)100%、95%、90%、85%乙醇梯度水化；采用95 ℃下檸檬酸抗原修復(fù)15 min，充分暴露抗原；PBS沖洗3次，每次3 min；過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清封閉30 min；于每張切片上加入一抗Pg兔抗人單克隆抗體(VPg一抗:VPBS=1∶1 000)50 μL，4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫1 h，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加山羊抗鼠/兔聚合物室溫下孵育30 min；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加SP室溫封閉10 min；PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色10 min；蒸餾水沖洗10 min；蘇木素復(fù)染10 min，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)挑選5個(gè)高倍鏡視野(×400)觀察肺癌組織切片中Pg感染情況.以兩名資深病理科醫(yī)生判定的陽性切片為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗的陰性切片為陰性對照.陽性感染判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞漿出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性感染.染色強(qiáng)度計(jì)分：無色至淺黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分，深褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：<5%為0分，≥5%且<25%為1分，≥25%且<50%為2分，≥50%且<75%為3分，≥75%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積對每個(gè)視野進(jìn)行綜合評分，0分定義為陰性，1～12分定義為陽性，取5個(gè)視野評分均值為最終免疫組織化學(xué)評分.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者臨床資料一般特征

共納入小細(xì)胞肺癌患者83例，肺腺癌患者103例，肺鱗癌患者84例.小細(xì)胞肺癌及肺鱗癌患者中男性、吸煙及飲酒患者比例顯著高于肺腺癌患者(表1).

表1 270例肺癌患者臨床特征

Table 1 Characteristics of clinical data of 270 patients with lung cancer

n(%)

1)與肺腺癌組比較，P<0.05.

1)Compared with lung adenocarcinoma group，P<0.05.

2.2 肺癌組織及癌旁肺組織中Pg感染情況

肺癌(小細(xì)胞肺癌、肺腺癌及肺鱗癌)癌組織及癌旁肺組織中均可見細(xì)胞漿出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，為Pg感染陽性(圖1).小細(xì)胞肺癌組織(31.33%)及肺鱗癌組織(36.90%)中Pg感染陽性率高于肺腺癌組織(28.16%)，且三者免疫組化評分均顯著高于相應(yīng)癌旁肺組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,表2).

2.3 Pg感染與肺癌患者臨床特征的相關(guān)性

Pg感染與小細(xì)胞肺癌、肺腺癌及肺鱗癌患者吸煙、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡及分化程度無關(guān)(表3).

表2 肺癌組織及癌旁肺組織中Pg感染免疫組化評分分析

Table 2 Analysis of differences in immunohistochemical scores of Pg infection in lung cancer tissues and adjacent lung tissues

分

A：小細(xì)胞肺癌組織； B：肺腺癌組織； C：肺鱗癌組織； D：癌旁肺組織.

2.4 Pg感染與肺癌患者5年生存預(yù)后相關(guān)性

83例小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后5年總生存率及中位生存時(shí)間分別為7.23%、(17.00±2.26)個(gè)月，其中Pg感染陽性組5年生存率及中位生存時(shí)間為0.00%、(12.00±2.03)個(gè)月，Pg感染陰性組5年生存率及中位生存時(shí)間為10.53%、(17.00±4.61)個(gè)月.103例肺腺癌患者術(shù)后5年總生存率及中位生存時(shí)間分別為19.42%、(31.00±4.61)個(gè)月，其中Pg感染陽性組5年生存率及中位生存時(shí)間為6.90%、(19.00±5.38)個(gè)月，Pg感染陰性組5年生存率及中位生存時(shí)間為24.32%、(34±2.87)個(gè)月.84例肺鱗癌患者術(shù)后5年總生存率及中位生存時(shí)間分別為20.24%、(27.00±4.17)個(gè)月，其中Pg感染陽性組5年生存率及中位生存時(shí)間為9.68%、(15.00±2.23)個(gè)月，Pg感染陰性組5年生存率及中位生存時(shí)間為26.42%、(36.00±2.73)個(gè)月.小細(xì)胞肺癌、肺腺癌及肺鱗癌患者中，Pg感染陽性組5年生存率及中位生存時(shí)間均明顯低于Pg感染陰性組(P<0.05)，且三種病理類型中，肺鱗癌患者Pg感染陰性組與陽性組中位生存時(shí)間之差(21個(gè)月)顯著高于肺腺癌(15個(gè)月)與小細(xì)胞肺癌(5個(gè)月)患者(表4，圖2、3).

表3 Pg感染與肺癌患者臨床特征相關(guān)性Table 3 Correlation between Pg infection and clinical features of lung cancer n(%)

1) 與Pg感染陰性組比較,P<0.05.

1)Compared with the group of negative expression of Pg,P<0.05.

表4 Pg感染陽性與陰性肺癌患者生存時(shí)間(月)的均數(shù)和中位數(shù)

Table 4 Means and medians for the survival time (months) of lung cancer patients with the positive and negative expression of Pg

病理類型Pg感染生存時(shí)間均數(shù)生存時(shí)間中位數(shù)估計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)誤95%置信區(qū)間下限上限估計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)誤95%置信區(qū)間下限上限2P小細(xì)胞肺癌陽性15.8082.51510.87920.73612.0002.0348.01415.9867.0340.008陰性25.1932.63020.03830.34817.0004.6137.95826.042整體22.2532.02218.29126.21517.0002.26412.56221.438肺腺癌陽性24.7933.37118.18531.40119.0005.3828.45129.5495.3890.020陰性34.0002.20829.67238.32834.0002.86628.38239.618整體31.4081.89327.69735.11931.0004.61321.95940.041肺鱗癌陽性21.1943.21814.88727.50015.0002.22610.63719.3639.2400.002陰性35.0752.73129.72340.42836.0002.73030.65041.350整體29.9522.21625.60834.29727.0004.16618.83535.165

圖2 肺癌患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線

Fig.2 Kaplan-meier survival curve at 5 years after surgery of lung cancer patients

圖3 Pg感染陽性組與陰性組肺癌患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線

Fig.3 Kaplan-meier survival curve at 5 years after surgery of lung cancer patients with positive and negative expression of Pg

3 討論

肺癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率連年增長.雖然目前對于肺癌治療有手術(shù)[20]、化療、放療等手段，但治療效果仍不令人滿意.因此，尋找與肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，以預(yù)測其生存預(yù)后情況，為治療提供可能的手段，具有極其重要的意義.長期以來，肺癌的研究大都集中在癌細(xì)胞自身，主要是基因水平發(fā)生改變[21-22]，而有關(guān)病原微生物的慢性感染則探討的不多.實(shí)際上，病原微生物的長期定植與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間存在重要的病理學(xué)關(guān)聯(lián)，腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制不僅是癌細(xì)胞內(nèi)源性的變遷，同時(shí)也包括腫瘤所處微環(huán)境所賦予的改變.

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長的特殊環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外間質(zhì)相互作用所形成[23].研究表明，多種病原微生物均可通過削弱宿主微環(huán)境中免疫細(xì)胞殺傷力、誘導(dǎo)免疫耐受甚至功能耗竭，最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，并在腫瘤細(xì)胞中長期定植，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24].如幽門螺桿菌與胃癌，人乳頭瘤病毒與宮頸癌，肺炎衣原體與肺癌，大腸桿菌與結(jié)腸癌等，這些病原微生物均可通過長期定植于機(jī)體，調(diào)控腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-7].

Pg是毒力最強(qiáng)的口腔致病菌之一，且進(jìn)入細(xì)胞的過程是瞬時(shí)的，并可長期定植.其隨血液循環(huán)可輕易播散至全身，參與疾病進(jìn)程.研究發(fā)現(xiàn)，Pg可不間斷侵入感染大腦，破壞神經(jīng)元，是阿爾茲海默癥的高危險(xiǎn)因素[9].近年來大量研究結(jié)果已表明，Pg抗體水平與冠狀動脈粥樣硬化、呼吸道感染及骨質(zhì)疏松等系統(tǒng)性疾病臨床風(fēng)險(xiǎn)皆呈正相關(guān)[8,10-11].更為嚴(yán)峻的是，作為介導(dǎo)長期慢性感染而致癌的重要致病菌之一，Pg已被證實(shí)與頭頸部鱗癌[12-13]、口腔癌[14]、食管癌[15-16]、胃癌[17]、胰腺癌[18]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測肺癌患者手術(shù)切除的癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織石蠟包埋標(biāo)本中Pg感染情況，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌、肺腺癌及肺鱗癌患者癌組織中Pg感染陽性率分別為31.33%、28.16%及36.90%，且其免疫組化評分均顯著高于相應(yīng)癌旁肺組織，首次表明Pg可定植于肺癌組織中，且在癌組織中的定植量顯著高于癌旁肺組織，提示癌細(xì)胞的微環(huán)境更利于Pg生存.而小細(xì)胞肺癌與肺鱗癌患者Pg感染陽性率高于肺腺癌患者，可能跟二者多為吸煙飲酒的男性患者有關(guān).本研究通過2檢驗(yàn)分析Pg感染與肺癌患者臨床病理特征相關(guān)性，顯示在肺癌(小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)患者中，Pg感染與吸煙、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，提示長期吸煙、飲酒會導(dǎo)致更加惡劣的口腔環(huán)境，而Pg更容易在這種環(huán)境下感染并定植，從而促進(jìn)肺癌的惡性進(jìn)展.本研究還發(fā)現(xiàn)在肺癌(小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)患者中，Pg感染陽性組5年生存率及中位生存時(shí)間均明顯低于Pg感染陰性組，提示有效清除Pg可能延長肺癌患者的生存期；且三種病理類型中，肺鱗癌患者Pg感染陰性組與陽性組中位生存時(shí)間之差顯著高于肺腺癌與小細(xì)胞肺癌患者，提示Pg的長期定植可能更易促進(jìn)肺鱗癌的惡性進(jìn)展，有效清除Pg對肺鱗癌患者更具臨床意義.由于疾病的多樣性和復(fù)雜性，Pg的具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討，但阻止Pg在宿主體內(nèi)持久定植，對于積極有效地根治致病菌相關(guān)性疾病具有非常重要的意義.

綜上所述，Pg通過長期定植于肺癌細(xì)胞，促進(jìn)了肺癌的轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展，有效清除Pg可能延長肺癌(特別是肺鱗癌)患者的生存期，在肺癌的臨床治療方面具有十分重要的科學(xué)理論意義和廣泛的應(yīng)用前景.