丙酮酸激酶M2在骨肉瘤中的表達(dá)及其生物學(xué)功能

鞠薇薇， 于生金， 林黎娟， 呂秀梅， 滕小宇， 江黎黎*

(1.遼東學(xué)院 醫(yī)學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)研究室， 遼寧 丹東 118003； 2. 丹東市第一醫(yī)院 病理科， 遼寧 丹東 118003)

骨肉瘤是兒童和青少年時(shí)期最常見的高級(jí)別惡性腫瘤，早期就可以發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移.近年來，隨著診療手段的進(jìn)步和靶向治療的成熟，5年存活率有所提升，但是由于該腫瘤具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)和腫瘤耐藥已發(fā)生等特點(diǎn)，增加了骨肉瘤患者的不良預(yù)后，骨肉瘤依然是全世界兒童癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1].因此，深入了解骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療策略和分子靶標(biāo)對(duì)于骨肉瘤治療至關(guān)重要.丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是糖酵解的關(guān)鍵酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸[2].PK具有4種同工酶，L型、R型、M1型和M2型，其中M2型即丙酮酸激酶M2(PKM2).通常不同組織和細(xì)胞表達(dá)不同亞型的丙酮酸激酶，而在腫瘤的形成過程中，丙酮酸激酶亞型的表達(dá)都逐漸失去其組織特異性[3]，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)橐员磉_(dá)PKM2為主，PKM2的高表達(dá)在腫瘤組織中是一種普遍存在的現(xiàn)象，而PKM2的表達(dá)水平與多種腫瘤的臨床分期和病理分級(jí)相關(guān)[4].PKM2在骨肉瘤方面的功能及分子機(jī)制方面尚不清楚.

本研究擬檢測(cè)PKM2在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平及其與骨肉瘤患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，并初步探討其中可能的分子機(jī)制，以期為深入研究PKM2在骨肉瘤中的作用提供臨床和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 資料與方法

1.1 資料與材料

1.1.1 患者資料

收集丹東市第一醫(yī)院2007年1月至2013年12月期間手術(shù)切除的骨肉瘤患者組織標(biāo)本90例.所有病例經(jīng)病理確診，且患者術(shù)前均未經(jīng)放化療及其他生物治療.入選患者均知情同意，臨床信息見表1.同時(shí)，利用https://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/數(shù)據(jù)庫中的88例骨肉瘤患者分析骨肉瘤組織中PKM2mRNA表達(dá)水平與患者生存預(yù)后的關(guān)系.

1.1.2 細(xì)胞及試劑

細(xì)胞系U2OS和MG63購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，兔抗人PKM2多克隆抗體(15822-1-AP)購自美國(guó)Proteintech公司，鼠抗人單克隆抗體P21(F-5)、P27(F-8)、cyclinD1(A-12)、β-actin(C-2)均購自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組化用一抗稀釋液、通用二抗(PV-6000)及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司.蛋白質(zhì)印記所用二抗購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司.PKM2抑制劑Shikonin購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡裸鼠10只，雄性，平均體質(zhì)量20 g，購自北京維通利華公司.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色及評(píng)分

免疫組化染色按照常規(guī)程序利用德國(guó)Dako公司 Link48全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色，一抗用抗體稀釋液1∶200稀釋.免疫組化結(jié)果由兩名病理學(xué)家獨(dú)立盲評(píng)，評(píng)分方案為：0，無染色；1+，胞質(zhì)弱陽性；2+，胞質(zhì)染色中等強(qiáng)度；3+，胞質(zhì)強(qiáng)陽性.評(píng)分為2+或3+的腫瘤為高表達(dá)，評(píng)分為0或1+的腫瘤為低表達(dá).

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及沉默細(xì)胞系的構(gòu)建

U2OS細(xì)胞用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液McCoy′s 5A培養(yǎng)，MG63細(xì)胞用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中.將PKM2-shRNA序列5′-GTTCGGAGGTTTGATG-AAATC-3′插入到慢病毒載體pLKO.1中，構(gòu)建沉默PKM2的質(zhì)粒；隨后在293T細(xì)胞中包裝病毒.48 h后收集病毒分別感染U2OS和MG63細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定沉默PKM2的U2OS和MG63細(xì)胞.

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡

采用濃度分別為50 mmol/L的Tris-HCL (pH=7.5)、150 mmol/L的NaCl、體積分?jǐn)?shù)分別為1%的NP-40、0.5%脫氧膽酸鹽、0.1%十二烷基硫酸鈉組成的裂解液提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA法測(cè)量蛋白濃度并均一.50 μg總蛋白利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%凝膠電泳分離，然后250 mA轉(zhuǎn)膜2 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜.質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫1 h孵育.使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)，Western blot成像儀成像，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值.

1.2.4 CCK8繪制生長(zhǎng)曲線

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，于96孔板內(nèi)每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72、96及120 h)在對(duì)應(yīng)的孔板中分別加入10 μL的CCK8溶液，孵育4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的光密度(optical density, OD)，繪制生長(zhǎng)曲線.

1.2.5 二維克隆形成實(shí)驗(yàn)

胰酶消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，于6孔板中每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，兩周后棄去培養(yǎng)液，在-20 ℃用甲醇固定克隆6 min，結(jié)晶紫溶液室溫染色.顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù).

1.2.6 Soft agar克隆形成實(shí)驗(yàn)

用雙蒸水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.7%和1.2%的瓊脂糖，高壓滅菌后置42 ℃水浴中保持融化狀態(tài).取等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖和2倍DMEM混勻，每孔1.5 mL加入6孔板，室溫凝固.制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，取等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的瓊脂糖和2倍DMEM混勻，加入100 μL細(xì)胞懸液混勻，取1 mL加入已經(jīng)固化的下層膠上.37 ℃孵箱培養(yǎng)14 d，結(jié)晶紫1 h染色.計(jì)數(shù)比較各組克隆形成情況.

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

用不含血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，上室中加入1×104細(xì)胞，在下室中加入500 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液； 16～24 h后，棉簽擦拭上室中未穿過小室膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下采集圖像，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.2.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

制備單細(xì)胞懸液，每孔5×105細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)16～24 h后形成單層細(xì)胞.用10 μL移液搶槍頭或者無菌牙簽在細(xì)胞表面呈“一”字劃痕，PBS清洗至無脫落細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48 h在顯微鏡下拍照并測(cè)量劃痕寬度.

1.2.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

8周齡裸鼠10只，SPF級(jí)屏障系統(tǒng)飼養(yǎng).裸鼠隨機(jī)分成2組，對(duì)照組shctrl(5只)和PKM2沉默組shPKM2(5只)；取兩組的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U2OS細(xì)胞shctrl和shPKM2，制備單細(xì)胞懸液，離心后用生理鹽水清洗2次.兩組細(xì)胞以5×105/點(diǎn)接種于裸鼠腹股溝皮下，觀察成瘤情況，每天測(cè)量腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積(腫瘤體積=長(zhǎng)×寬2/2)于接種后23 d麻醉小鼠，剝?nèi)×鰤K.

1.2.10 流式細(xì)胞學(xué)分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U2OS和MG63相關(guān)細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液至流式管內(nèi)，150×g/min離心去上清，冰PBS沖洗細(xì)胞2～3次，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇4 ℃固定4 h，每1 mL PBS中加入20 μL碘化丙錠(質(zhì)量濃度為50 μg/mL)和50 μL RNase (質(zhì)量濃度為10 mg/mL)制備上樣緩沖液，每管樣品用1 mL上樣緩沖液重懸后，避光放置10 min，用美國(guó)貝克曼 Quanta SC流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PKM2在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖1A)顯示，PKM2的陽性信號(hào)主要定位在骨肉瘤細(xì)胞的胞漿.根據(jù)染色評(píng)分結(jié)果，將90例骨肉瘤組織分成兩組，高表達(dá)組51例，低表達(dá)組39例.分析PKM2表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期等臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系(表1).腫瘤直徑≥5 cm的病例中PKM2的高表達(dá)率83.3%(30/36)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直徑<5 cm的病例(圖1B).同時(shí)PKM2的表達(dá)水平與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(2=7.30,P=0.007)及臨床分期均呈正相關(guān)(2=8.44，P=0.004)(圖1C, D).

Kaplan-Meier單因素生存分析表明，PKM2的表達(dá)水平與患者總生存(圖1E)和無轉(zhuǎn)移生存(圖1F)之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，組織中高表達(dá)PKM2的骨肉瘤患者預(yù)后較差.同時(shí)Cox多因素風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，除了腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，PKM2高表達(dá)也是骨肉瘤患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.03，表2).此外，經(jīng)分析https://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi的數(shù)據(jù)，結(jié)果也表明不管是總生存還是無轉(zhuǎn)移生存，PKM2mRNA高表達(dá)的患者預(yù)后均較差(圖1G, H).

2.2 沉默PKM2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中沉默PKM2的表達(dá)(圖2A)，細(xì)胞的增殖能力顯著被抑制(圖2B，P<0.05).同時(shí)，二維克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖2C)和Soft agar克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖2D)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默PKM2的表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞的二維克隆形成(t=11.28,P<0.01)及懸浮克隆形成(t=5.42,P<0.01)的能力.

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(圖2E)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(圖2F)結(jié)果顯示，沉默PKM2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力也有顯著的抑制作用(P<0.05).在骨肉瘤細(xì)胞系MG63中，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，得到一致的結(jié)果.沉默PKM2后，細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力以及遷移能力均受到顯著的抑制(P<0.05, 圖3).而且小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默PKM2可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)(t=3.80,P=0.02)(圖3F, G).

表1 PKM2蛋白表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床病理指標(biāo)

表2 骨肉瘤患者預(yù)后的多因素生存分析

2.3 抑制PKM2的活性對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

利用PKM2的抑制劑shikonin作用于骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和MG63，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、克隆形成以及遷移能力的變化.首先應(yīng)用質(zhì)量濃度為0.2 mg/L的shikonin作用于骨肉瘤細(xì)胞，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(圖4A).而且，骨肉瘤細(xì)胞對(duì)該抑制劑有明顯的質(zhì)量濃度依賴性(圖4B).此外，應(yīng)用shikonin后細(xì)胞克隆形成以及遷移能力也受到顯著的抑制(圖4C, D).

A：免疫組化DAB染色檢測(cè)PKM2在骨肉瘤組織中的表達(dá)(×200)；B：PKM2表達(dá)水平與腫瘤直徑之間的關(guān)系；C：PKM2表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系；D：PKM2表達(dá)水平與臨床分期之間的關(guān)系；E：PKM2 對(duì)骨肉瘤患者總生存的影響；F：PKM2對(duì)骨肉瘤患者無轉(zhuǎn)移生存的影響；G：PKM2mRNA對(duì)骨肉瘤患者總生存的影響；H：PKM2mRNA對(duì)骨肉瘤患者無轉(zhuǎn)移生存的影響.

A: PKM2 expression in osteosarcoma tissues (DAB，staining×200); B: The relationship of PKM2 expression level and tumor diameter; C: The relationship of PKM2 expression level and distant metastasis; D: The relationship of PKM2 expression level and clinical stage; E: The effect of PKM2 expression on the overall survival; F: The effect of PKM2 expression on the metastasis-free survival; G: The effect of PKM2 mRNA expression on the overall survival; H: The effect of PKM2 expression on the metastasis-free survival.

圖1 PKM2在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平及其與腫瘤特征和患者預(yù)后的關(guān)系

Fig.1 PKM2 expression in osteosarcoma and the relationships with clinicopathological features

A:Western blot檢測(cè)PKM2沉默效率；B:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞增殖的影響, 1)兩組比較，P<0.05；C:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響；D:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞懸浮克隆形成能力的影響；E:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞遷移的影響；F:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞遷移愈合能力的影響.

A: The expression of PKM2 was detected by Western blotting; B: The proliferation of shPKM2 and control cells was detected,1)P<0.05; C: The colony formation of shPKM2 and control cells was detected by colony formation assay; D: The colony formation of shPKM2 and control cells was detected by soft agar colony formation assay; E: The migration of shPKM2 and control cells was detected by transwell; F: The migration of shPKM2 and control cells was detected by wound-healing assay.

圖2 沉默PKM2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS生物學(xué)行為的影響

Fig.2 The effects of silencing PKM2 on the biological behaviors of osteosarcoma cell line U2OS

A:Western blot檢測(cè)PKM2的表達(dá)水平；B:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞增殖的影響, 1)兩組比較，P<0.05；C:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)量的影響；D:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞懸浮克隆形成數(shù)量的影響；E:沉默PKM2對(duì)細(xì)胞遷移的影響；F:沉默PKM2對(duì)小鼠體內(nèi)成瘤的影響；G:小鼠瘤塊質(zhì)量的差異.

A: The expression of PKM2 was detected by Western blotting, 1)P<0.05; B: The proliferation of shPKM2 and control cells was detected; C: The colony formation of shPKM2 and control cells was detected by colony formation assay; D: The colony formation of shPKM2 and control cells was detected by soft agar clony formation assay; E: The migration of shPKM2 and control cells was detected by transwell; F: The effect of shPKM2 on tumor proliferation in mice; G: The weight of tumor in mice.

圖3 沉默PKM2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63生物學(xué)行為的影響

Fig.3 The effects of silencing PKM2 on the biological behaviors of osteosarcoma cell line MG63

A: 0.2 mg/L shikonin對(duì)細(xì)胞增殖的影響；B:不同濃度shikonin 對(duì)細(xì)胞增殖的影響；C:shikonin對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響；D:細(xì)胞克隆形成計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)；E:shikonin對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；F:遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì).

A: The proliferation of shikonin and control cells was detected by MTT method; B: The effect of different dose of shikonin on cell detected; C: The colony formation of shikonin and control cells was detected by colony formation assay; D: Statistics of cell clone formation; E, The migration of shikonin and control cells was detected by transwell; F, Statistics of migration cell.

圖4 PKM2抑制劑shikonin對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS和MG63生物學(xué)行為的影響

Fig.4 The effects of PKM2 inhibitor shikonin on the biological behaviors of osteosarcoma cell line U2OS and MG63

2.4 PKM2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響

通過以上實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)明確PKM2在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而且PKM2可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PKM2對(duì)細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示，不管是利用PKM2抑制劑shikonin還是利用小RNA沉默PKM2，骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的G1期細(xì)胞比例顯著增多(P<0.05)，即抑制PKM2可以使骨肉瘤細(xì)胞阻滯在G1期(圖5A, B).

為了探討其中的分子機(jī)制，利用Western blot方法檢測(cè)抑制PKM2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞CyclinD1表達(dá)水平的影響，結(jié)果提示抑制PKM2可以抑制CyclinD1的蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21Cip1和p27Kip1的表達(dá)(圖5C).

A: The effect of shikonin on cell cycle; B: The effect of shPKM2 on cell cycle; C: The effect of shPKM2 on CyclinD1, P21 and P27 expression; D: The effect of shikonin on CyclinD1, P21 and P27 expression.A.沉默PKM2對(duì)細(xì)胞周期的影響；B.抑制劑shikonin對(duì)細(xì)胞周期的影響；C.沉默PKM2對(duì)細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、p21、p27表達(dá)水平的影響；D.抑制劑shikonin對(duì)細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、P21、P27表達(dá)水平的影響.

3 討論

惡性腫瘤不僅是一種與基因有關(guān)的疾病，更是一種能量代謝性疾病.腫瘤細(xì)胞為了滿足其快速增殖的需要，其利用核酸、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物等物質(zhì)的量必須翻倍，所以腫瘤細(xì)胞必將調(diào)整其代謝行為，盡可能利用可獲取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是對(duì)糖類物質(zhì)的快速利用和消耗[5].與正常細(xì)胞代謝葡萄糖的方式不同，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足時(shí)依然優(yōu)先選擇產(chǎn)生大量乳酸的糖酵解途徑進(jìn)行葡萄糖代謝，這種特有的能量獲取方式被稱為“Warburg 效應(yīng)”[6]. 目前，“Warburg效應(yīng)”作為腫瘤的一個(gè)典型標(biāo)志已被廣泛認(rèn)可[7]，而且在Cell雜志發(fā)表的綜述上已經(jīng)將該特性列入腫瘤十大特征之一[8].

丙酮酸激酶是葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶，其活性決定著細(xì)胞的糖酵解方式和代謝底物水平.PKM2是丙酮酸激酶的一個(gè)亞型，PKM2的表達(dá)可能與Warburg效應(yīng)直接相關(guān)[9-10].除了調(diào)控代謝，PKM2還可進(jìn)入細(xì)胞核，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11].同時(shí)，PKM2作為蛋白激酶可以激活100多種蛋白，其中包括ERK1/2，PKM2的持續(xù)活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[12].研究發(fā)現(xiàn)PKM2在多種上皮來源的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而且PKM2的表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期和病理分級(jí)呈正相關(guān)[13-15].但間質(zhì)來源的腫瘤PKM2的表達(dá)情況及其在骨肉瘤中的作用尚未清楚.

在本研究中，檢測(cè)PKM2在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平，并分析PKM2的表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKM2表達(dá)水平與腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，即PKM2高表達(dá)的患者腫瘤體積較大、容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期較高；而且，癌組織中PKM2表達(dá)水平較高的骨肉瘤患者不管是總生存還是無轉(zhuǎn)移生存，預(yù)后均較差，PKM2高表達(dá)是骨肉瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素.因此推測(cè)PKM2在骨肉瘤的惡性進(jìn)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用，與PKM2在其他腫瘤中的臨床意義是一致的[16].

同時(shí)，本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了佐證，PKM2沉默后，骨肉瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成及遷移能力均受到顯著的抑制；而且小鼠體內(nèi)成瘤能力也受到顯著的影響，PKM2沉默組細(xì)胞的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組.同時(shí)，利用PKM2的抑制劑也得到了相同的結(jié)果，應(yīng)用shikonin后，細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力均受到抑制，與PKM2在其他腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能和意義是一致的[10].為探究其中的分子機(jī)制，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了PKM2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響.本研究結(jié)果顯示抑制PKM2可以使細(xì)胞周期阻滯在G1期，而且抑制PKM2后骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)CyclinD1的表達(dá)水平顯著下降，p21和p27的表達(dá)水平增加，提示PKM2通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平進(jìn)而影響細(xì)胞周期.而PKM2是如何影響骨肉瘤細(xì)胞遷移能力需要進(jìn)一步研究.

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PKM2在骨肉瘤惡性進(jìn)展過程中起著重要作用，有可能成為骨肉瘤靶向生物治療的潛在靶點(diǎn).