LncRNA WDR86-AS1調節(jié) FOXO3a對滋養(yǎng)細胞增殖和侵襲能力的影響

張展， 黃晨曦， 王萍， 劉靈

(1.鄭州大學 第三附屬醫(yī)院 檢驗科, 河南 鄭州 450052； 2.鄭州大學 第三附屬醫(yī)院 產前診斷中心, 河南 鄭州 450052)

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠特發(fā)性綜合征，以妊娠20周新發(fā)高血壓 (≥140/90 mmHg)和蛋白尿(≥300 mg/24 h)為主要特征,目前世界的發(fā)病率為3%～5%,是造成胎兒和產婦發(fā)病和死亡的主要原因，但其具體發(fā)病機制仍未知[1].研究表明滋養(yǎng)細胞增殖能力降低和侵襲能力不足可能是引起子癇前期發(fā)病的重要原因[2].長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, LncRNA)是一種長度超過200 bp的非編碼RNA，因為其不編碼蛋白質，一直被認為是基因組轉錄的“噪音”[3]，但是近年來隨著高通量測序和生物信息學技術的發(fā)展，越來越多的LncRNA及其與疾病的關系被大家認知.胎盤組織的研究發(fā)現LncRNA可能與子癇前期的發(fā)病相關[4].有研究表明LncRNAWDR86-AS1在PE胎盤組織中表達升高.叉頭框轉錄因子3a(forkhead box protein o 3a,FOXO3a)是叉頭框蛋白O家族的成員之一,這個家族包含4個成員:FOXO1、FOXO4、FOXO3a和FOXO6，其中以FOXO3a的分布和功能最為廣泛[5].FOXO3a主要調節(jié)細胞增殖、凋亡、 細胞周期、氧化應激和免疫應答等多方面功能[6].本研究選擇PE孕婦和健康孕婦的胎盤組織進行驗證,探究LncRNAWDR86-AS1調節(jié)FOXO3a對滋養(yǎng)細胞功能影響，以及可能參與子癇前期發(fā)病的機制.

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

選擇在鄭州大學第三附屬醫(yī)院分娩的子癇前期(PE)孕婦和健康孕婦的胎盤組織各25例，分為PE組和對照組.PE的診斷標準依據文獻[7]，排除多胎妊娠，妊娠糖尿病，慢性高血壓，慢性腎臟疾病等妊娠合并癥.研究經鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意.

1.1.2 試劑

人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo購自美國ATCC公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰酶購自Gibco公司.TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture和組織裂解液購自康為世紀，ReverTra Ace qPCR-RT kit 購自日本東洋紡公司.CCK-8購自日本同仁.Lipo3000TMreagent 購自Invitrogen公司，LncRNAWDR86-AS1 和FOXO3asiRNA購自廣州銳博公司.兔抗人FOXO3a單克隆抗體購自CST公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Abcam公司，HRP標記的山羊抗兔IgG購自鼎國公司.

1.2 方法

1.2.1 標本收集

胎盤娩出后15 min內從胎盤的母體面收集胎盤組織(1 cm3)，排除梗死、出血和鈣化區(qū)域，將取出的組織塊用生理鹽水沖洗并用濾紙吸去表面血液，一部分用體積分數為10%的甲醛脫水后用石蠟包埋，儲存用于免疫組化研究；一部分儲存在-80 ℃冰箱內用于RNA和蛋白的提取.

1.2.2 免疫組化

胎盤組織蠟塊切成4 μm的薄片固定在載玻片上，將切片在二甲苯中脫蠟，分級乙醇中水化.然后浸入檸檬酸抗原修復液中在微波爐中處理15 min，進行抗原修復，用體積分數為3% H2O2，37 ℃ 孵育15 min以抑制內源性過氧化物酶活性.滴加質量分數為10%的山羊血清封閉液在室溫孵育30 min.用兔抗人FOXO3a單克隆抗體(V一抗原液∶V一抗稀釋液=1∶800) 4 ℃孵育過夜.陰性對照按照相同方法用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理2 h.然后用二抗(V二抗原液∶V二抗稀釋液=1∶2 000,SP-9001,OriGene Technologies)孵育1 h.使用3,3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽底物試劑盒(ZSGB-BIO)顯色，用蘇木素，復染2 min.結果判斷采用半定量積分法，在細胞密集的區(qū)域內隨機選取5個高倍鏡視野，計數100個細胞.計算出陽性染色細胞的百分數進行評分，陽性細胞百分數為小于5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、大于75%分別記為0、1、2、3、4分；染色強度的評分：無著色、淺棕黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分.免疫組化積分是細胞陽性率評分與染色強度評分相乘之積.

1.2.3 細胞培養(yǎng)和LncRNAWDR86-AS1和FOXO3asiRNA轉染

將HTR8/SVneo細胞置于含有質量分數為10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，并在37 ℃體積分數為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合達90%用胰酶進行傳代.在6孔板中鋪細胞1×105/孔，分為siNC組和siWD組，當細胞融合達60%時，使用Lipo3000TM將陰性對照(nonsense control,NC)和LncRNAWDR86-AS1siRNA轉染入HTR8/SVneo細胞中，培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實驗；在6孔板中鋪細胞1×105/孔，分為siNC組和siFOXO3a組,同樣的方法將NC和FOXO3asiRNA轉染入HTR8/SVneo細胞中，培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實驗.

1.2.4 Quantitative RT-PCR檢測

用TRIzol Reagent提取組織和細胞的總RNA，并用ReverTra Ace qPCR-RT kit在37 ℃ 15 min, 50 ℃ 5 min 和98 ℃ 5 min下逆轉錄為cDNA.使用UItraSYBR Mixture在StepOnePlusTMReal-Time PCR System上進行PCR的擴增，擴增的條件：95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min 共40個循環(huán).引物序列：LncRNAWDR86-AS1上游:5′-ACCGCTGACCTTACCTACTTCCTC-3′,下游:5′-AGGCTTCCGTCCTCAGTTCCAG-3′;FOXO3a上游:5′-GGTGCTAAGCAGGCCTCATCTC-3′,下游: 5′-AATGGCGTGGGATTCACAAAG-3′; GAPDH上游: 5′-AGAACGGGAAGCTTGTCATC-3′,下游:5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′.以GAPDH為內參，用2-ΔΔCT來計算LncRNAWDR86-AS1和FOXO3amRNA的相對表達量.

1.2.5 Western blot檢測

用V組織裂解液∶V蛋白酶抑制劑=100∶1提取胎盤組織和細胞的總蛋白，BCA法進行蛋白定量，配置質量分數為8%的分離膠和質量分數為5%的濃縮膠，每孔加入40 μg蛋白進行電泳.電泳后濕轉至PVDF膜上，膜在質量分數為5%脫脂奶粉封閉2 h后,在4 ℃冰箱孵育過夜, 一抗與二抗原液均使用含有質量分數為5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋,V一抗原液∶VTBST溶液=1∶1 000.室溫復溫1 h，TBST洗3×10 min，然后室溫孵育1 h,V二抗原液∶VTBST溶液=1∶10 000，TBST洗3×15 min后ECL化學發(fā)光法顯色.用Image J軟件分析條帶灰度值，計算FOXO3a蛋白的相對表達.

1.2.6 CCK-8檢測

用NC和LncRNAWDR86-AS1或FOXO3asiRNA轉染HTR8/SVneo細胞，轉染24 h后，按每孔5×103個鋪于96孔板中，每組設5個重復，在含有質量分數為10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1 h,檢測細胞活力.

1.2.7 Transwell分析

Transwell 小室鋪膠，細胞轉染24 h后消化制成無血清細胞懸液(2.5×108/L)，上室加200 μL的細胞懸液，下室加750 μL含質量分數為20%的胎牛血清的培養(yǎng)基，在37 ℃，體積分數為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用棉簽擦除上室的細胞和基質膠，PBS洗3遍，體積分數為4 %多聚甲醛固定15 min，質量分數為0.1%結晶紫染色10 min后拍照，高倍鏡下隨機取3個視野計數，取平均值，實驗獨立重復3次.

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數據均使用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析.計量資料均采用(均數±標準差)表示，兩組定量資料使用t檢驗，相關性采用Spearman相關分析,以P<0.05為有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 對照組和PE組臨床資料比較

對照組和PE組在分娩年齡上無統(tǒng)計學意義，但是PE組在孕周、收縮壓、舒張壓和蛋白尿含量方面均高于對照組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，在孕周和新生兒體質量低于對照組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05，表1).

組別分娩年齡/歲孕周/周收縮壓/mmHg舒張壓/mmHg24 h蛋白尿/g新生兒體質量/g對照組31.92±4.6938.50±0.50113.64±7.1372.36±8.610.09±0.033552.4±346.01PE組32.28±4.0732.00±1.67162.68±14.56103.20±10.074.92±2.791447.2±389.78P值0.780.001)0.001)0.001)0.001)0.001)

1)與對照組相比較,P<0.001.

1)Compared with the control group,P<0.001

2.2 LncRNA WDR86-AS1、FOXO3a mRNA及FOXO3a蛋白在對照組和PE組中表達

PE組中LncRNAWDR86-AS1、FOXO3amRNA和FOXO3a蛋白表達均高于對照組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05，表2，圖1).

表2 LncRNAWDR86-AS1、FOXO3amRNA和FOXO3a蛋白在胎盤組織中的表達

組別nLncRNA WDR86-AS1FOXO3a mRNAFOXO3a 蛋白對照組250.30±0.180.89±0.290.35±0.08PE組251.71±0.961)1.66±0.891)1.07±0.051)

1)與對照組相比較，P<0.05.

1)Compared with the control group,P<0.05

圖1 FOXO3a蛋白在對照組和PE組胎盤組織中表達

2.3 FOXO3a在對照組和PE組中的表達及分布及LncRNA WDR86-AS1和FOXO3a 在PE組中表達的相關性

FOXO3a在PE組滋養(yǎng)細胞的胞質和胞核中均有表達，且PE組表達(4.72±2.41)高于對照組(1.40±1.08)，有統(tǒng)計學差異(t=-6.29,P<0.05,圖2A).LncRNA WDR86-AS1和FOXO3a 在PE組中表達呈正相關(r=0.54,P<0.05,圖2B).

圖2A FOXO3a在對照組和PE組胎盤組織中的表達(×200)

圖2B PE組織中WDR86-AS1與FOXO3a表達的相關性

Fig.2B The correlation of expression between WDR86-AS1 and FOXO3a in preeclampsia placental tissue

2.4 轉染LncRNA WDR86-AS1 siRNA 后， LncRNA WDR86-AS1、FOXO3a mRNA和FOXO3a蛋白在siNC組和siWD組中的表達

siWD組LncRNAWDR86-AS1、FOXO3amRNA和FOXO3a蛋白表達均低于siNC組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05，表3和圖3).

表3 LncRNAWDR86-AS1、FOXO3amRNA和FOXO3a蛋白在siNC組與siWD組表達

組別LncRNA WDR86-AS1FOXO3a mRNAFOXO3a 蛋白siNC組1.02±0.231.01±0.211.58±0.07siWD組0.15±0.051)0.35±0.031)0.43±0.061)

1)與siNC組相比較，P<0.05.

1)Compared with the siNC group,P<0.05.

圖3 FOXO3a蛋白在siNC組與sIWD組細胞中表達

2.5 轉染LncRNA WDR86-AS1 siRNA 后，siNC組和siWD 組細胞的增殖活力和侵襲能力比較

HTR8/SVneo細胞轉染siRNA 0、24、48、72 h后發(fā)現，轉染24、48 h siWD組細胞增殖活力高于siNC組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05，表4)，轉染0、72 h兩組細胞增殖活力無統(tǒng)計學差異(表4).siWD組(77.4±10.24)侵襲細胞數目高于siNC組(45.8±6.22)，有統(tǒng)計學差異(P<0.05，圖4).

2.6 轉染FOXO3a siRNA后， FOXO3a mRNA和蛋白在siNC組和siFOXO3a組中的表達

siFOXO3a組FOXO3amRNA(0.20±0.04)表達低于siNC組(0.96±0.13)，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；siFOXO3a組(1.47±0.12)FOXO3a蛋白表達低于siNC組(0.08±0.04),有統(tǒng)計學差異(P<0.05，圖5).

表4 轉染LncRNAWDR86-AS1siRNA 0、24、48、72 h細胞增殖活力比較

組別0 h24 h48 h72 hsiNC0.48±0.070.71±0.060.99±0.101.14±0.05siWD0.46±0.090.90±0.121)1.22±0.101)1.24±0.07

1)與siNC組相比較，P<0.05.

1)Compared with the siNC group,P<0.05.

圖4 滋養(yǎng)細胞在siNC組與sIWD組侵裝能力的比較(×200)

Fig.4 Comparison of trophoblastic invasion in siNC and siWD groups(×200)

圖5 FOXO3a蛋白在siNC組與siFOXO3a組細胞中表達

2.7 轉染FOXO3a siRNA 后，siNC組和siFOXO3a 組細胞的增殖活力和侵襲能力比較

HTR8/SVneo細胞轉染FOXO3asiRNA 0、24、48和72 h后發(fā)現，轉染24、48 h siFOXO3a組細胞增殖活力高于siNC組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05,表5)，轉染0、72 h兩組細胞增殖活力無統(tǒng)計學差異 (表5).siFOXO3a組(65.8±13.42)侵襲細胞數目高于siNC組(41.4±7.1)，有統(tǒng)計學差異(P<0.05，圖6).

表5 轉染siRNA 0,24,48,72 h細胞增殖活力比較

組別0 h24 h48 h72 hsiNC組0.37±0.080.69±0.100.93±0.171.11±0.12siFOXO3a組0.41±0.090.89±0.171)1.09±0.131)1.21±0.11

1)與siNC組相比較，P<0.05.

1)Compared with the siNC group,P<0.05.

圖6 滋養(yǎng)細胞在siNC組與siWD組侵襲能力的比較(×200)

Fig.6 Comparison of trophoblastic invasion in siNC and siFOXO3a group(×200)

3 討論

在正常妊娠中原始細胞滋養(yǎng)細胞逐漸分化為絨毛外滋養(yǎng)細胞，該細胞進行增殖和侵襲促進螺旋動脈重塑，因此絨毛外滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲能力對胎盤的發(fā)育至關重要[8].研究發(fā)現滋養(yǎng)細胞增殖活力降低，侵襲不足等功能異常，引起的子宮螺旋動脈重鑄不足，胎盤淺著床，可能是子癇前期發(fā)病的主要原因[9].因此本研究選擇人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo細胞，該細胞系是進行滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲能力研究的常用細胞.

LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，可以在轉錄和轉錄后水平、翻譯水平、蛋白質的結構和細胞間相互作用等方面影響細胞增殖、侵襲、凋亡等多種生物學功能[10-12].越來越多的研究表明LncRNA與疾病的發(fā)生發(fā)展相關，例如癌癥[13]、神經精神疾病[14]、腎臟疾病[15]等.對PE胎盤組織的研究中也發(fā)現許多異常表達的LncRNA，且在細胞水平上改變LncRNA的表達可影響細胞的增殖、遷移和侵襲等功能，LncRNACRNDE在PE胎盤組織中下調，可通過調節(jié)miR-1277表達影響滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲和遷移[16]；LncRNATUG1在PE胎盤組織中下調，通過靶向調節(jié)miR-29b影響滋養(yǎng)細胞的增殖、凋亡、侵襲[17]；LncRNATCL6在PE胎盤組織中上調，過度表達LncRNA TCL6可通過靶向調節(jié)PTEN抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖[18].本研究中，在PE胎盤組織中發(fā)現LncRNAWDR86-AS1表達升高，與Li等[19]的研究一致.

FOXO3a是一個核轉錄因子，可與核輸出蛋白 14-3-3結合，由胞核轉移到胞質，抑制FOX03a的轉錄活性；此外還可通過隱藏核定位信號阻止其再次入核，進一步抑制FOXO3a的轉錄活性[20].FOXO3a可接收多個上游信號參與細胞信號通路，通過這種核穿梭機制實現失活和激活，影響細胞凋亡、增殖和DNA損傷等多方面能力[21].研究發(fā)現多種LncRNA可以通過調節(jié)FOXO3a表達，影響細胞的增殖、侵襲和凋亡等生物學功能，進而可能參與疾病的發(fā)展[22-24].目前FOXO3a在胎盤組織中的研究較少，主要發(fā)現FOXO3a在引產和流產病人的蛻膜組織和胎盤組織中表達升高[25]，本研究結果顯示在PE胎盤組織中FOXO3a的表達升高，但其表達與FOXO3a的關系尚未可知.通過對PE胎盤組織中LncRNAWDR86-AS1、FOXO3a表達進行相關性分析，發(fā)現二者表達呈正相關.在HTR-8/SVneo細胞中沉默LncRNAWDR86-AS1，細胞的增殖和侵襲能力增加，與Li等[19]的研究一致，但發(fā)現沉默LncRNAWDR86-AS1，FOXO3a的表達隨之降低，因此在滋養(yǎng)細胞中LncRNAWDR86-AS1可調節(jié)FOXO3a的表達.在HTR-8/SVneo細胞中沉默FOXO3a，細胞的增殖和侵襲能力增加，因此LncRNAWDR86-AS1可通過調節(jié)FOXO3a的表達影響滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲能力.在PE胎盤組織中LncRNAWDR86-AS1和FOXO3a的表達升高，可能影響了滋養(yǎng)細胞增殖侵襲能力、參與疾病的發(fā)展.

綜上所述，LncRNAWDR86-AS1可以調節(jié)FOXO3a的表達影響滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲能力，可能參與PE的發(fā)生發(fā)展.但是LncRNAWDR86-AS1調節(jié)FOXO3a的具體機制仍不清楚，將進一步探索.