miR-19a調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對結(jié)腸炎相關性結(jié)直腸癌的影響

羅燕 陳志濤 徐崇明 張曲

(1湖北省腫瘤醫(yī)院腹部放療科 湖北省結(jié)直腸癌臨床醫(yī)學研究中心 武漢市結(jié)直腸癌臨床醫(yī)學研究中心，湖北 武漢 430079；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院消化內(nèi)科)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)相關結(jié)直腸癌(UCRCC)是UC嚴重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率雖然僅占UC的1.2%～4.3%，但是卻占UC死亡例數(shù)的15%〔1,2〕。研究表明，UC發(fā)展為UCRCC最經(jīng)典的模式為“炎癥→不典型增生→惡性病變”，其中不典型增生是UCRCC發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)〔3〕。阻斷UC向UCRCC演變已成為結(jié)直腸癌早期防治的主要內(nèi)容。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是細胞一個基本病理生理現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、干細胞增殖轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用〔4〕。EMT是“炎性→癌變”的橋梁，針對EMT調(diào)控的研究，極有可能為防治非可控性炎癥和相關腫瘤提供新的途徑〔5〕。結(jié)直腸癌組織和細胞上皮標志物E-cadherin蛋白表達下調(diào)，而間質(zhì)標志物N-cadherin和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β蛋白表達上調(diào)，提示EMT與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展有關〔6〕。但是EMT是否參與了UC→UCRCC過程及相關的調(diào)控機制，仍需要深入研究。miR-19a是近年發(fā)現(xiàn)與UC有關的miRNA，在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜中miR-19a明顯增加〔7,8〕；上調(diào)結(jié)腸直腸癌細胞miR-19a表達可促進細胞的增殖和侵襲〔9〕。但是miR-19a對UCRCC的影響及相關作用機制依然未見報道。本研究通過氧化偶氮甲烷(AOM)/DSS建立UCRCC小鼠模型，利用miR-19a反義寡核苷酸慢病毒載體進行干預，旨在探討miR-19a對UCRCC的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 40只雄性C57BL/6J小鼠(6～8周齡)購自武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心〔許可證號：SYXK(鄂)2015-0025〕。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級，恒溫(22±2)℃、恒濕(50%～70%)，晝夜交替光照(12 h照明/12 h黑暗)，自由進食和飲水。本研究使用的動物嚴格按照國家《實驗動物福利倫理審查指南》和《湖北省實驗動物管理條例》相關要求。

1.2實驗試劑 AOM購自美國Sigma公司(純度99.5%)，DSS購自美國MP Biochemicals公司(純度99.2%)。miR-19a反義寡核苷酸慢病毒載體及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司，miR-19a引物購自上海吉凱基因化學技術有限公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，Taqman miRNA Reverse Transcription Kit購自美國Applied Biosystems公司，E-cadherin單克隆抗體、N-cadherin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3UCRCC模型制備 小鼠單次腹腔注射劑量為12 mg/mg的AOM，AOM注射1 w后，小鼠飲用含3.5% DSS飲用水1 w，之后飲用正常無菌水2 w；接下來循環(huán)重復DSS誘導2次，造模過程中小鼠自由進食，模型給藥方案見圖1。

圖1 UCRCC小鼠模型給藥計劃

1.4分組處理 小鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為4組：模型組、AS-miR-19a組、陰性對照組和正常對照組，每組10只小鼠。模型組、AS-miR-19a組、陰性對照組建立UCRCC小鼠模型，AS-miR-19a組于第7周(第2次DSS誘導后2 w)經(jīng)結(jié)腸灌注100 μl濃度為1×109TU/ml的miR-19a反義寡核苷酸腺病毒載體，AS-miR-19a腺病毒載體由上海吉瑪制藥技術有限公司合成(5′-UCAGUUUUGCAUAGAUUUGCACA-3′)。陰性對照組結(jié)腸灌注等量的miR-19a陰性對照腺病毒載體，陰性對照為miR-19a無義序列寡核苷酸(5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3′)。模型組灌注等量的生理鹽水。正常對照組小鼠不做任何處理，自由進食進水。

1.5小鼠一般情況評估 實驗開始后，每日記錄小鼠外觀、行為、體質(zhì)量、進食和進水量等，同時記錄小鼠糞便性狀及膿血便情況等。

1.6結(jié)腸組織取材 第11周，小鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉后，立即脫頸椎處死小鼠。超凈臺上解剖腹腔，取出肛緣至回盲部結(jié)腸，測量結(jié)腸的重量和長度。縱向切開結(jié)腸，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈，肉眼和顯微鏡下觀察黏膜水腫、糜爛和成瘤情況。

1.7結(jié)腸組織蘇木素-伊紅(HE)染色 用眼科剪將結(jié)腸組織剪成小塊，10%甲醛固定(pH7.4)，脫水、石蠟包埋，制成4 μm的切片。切片60℃烤10 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，伊紅復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.8實時定量PCR檢測組織miR-19a表達 將結(jié)腸組織剪成小塊置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，再加入Trizol試劑盒提供總RNA。以U6為內(nèi)參，按照Taqman miRNA Reverse Transcription Kit說明書進行操作。miR-19a上游： 5′-CCGCTAATACTGCCTGGTAATG-3′，下游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCA-3′；U6上游：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ ，下游：5′-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3′。采用兩步法進行PCR擴增，并制作標準曲線。PCR反應條件：95℃，5 s，60℃，45 s，共計45個循環(huán)。溶解曲線為95℃，15 s，60℃，30 s，95℃，15 s。按照2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.9免疫組織化學染色 石蠟包埋的樣本組織經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；加入檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)加熱30 min修復抗原，3%過氧化氫(H2O2)孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，加入5%山羊血清封閉2 h。樣本組織加入E-cadherin(1∶100)和N-cadherin(1∶100)抗體4℃孵育過夜，次日再加入二抗孵育1 h，然后光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.10Western印跡檢測 將腫瘤組織剪成小塊置于研磨中，研成粉末后加入放射性免疫沉淀法(RIPA)裂解液，提取總蛋白；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白含量。40 μg總蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后加入含有5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1.5 h，PBS沖洗2遍，加入E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶300)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜。次日PBS沖洗3遍，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，PBS洗滌后ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J 掃描蛋白灰度值。目的蛋白相對灰度值=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.11統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件、GraphPad Prism7.0軟件和Adobe Photoshop CS6軟件進行數(shù)據(jù)和圖形處理。計量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；不同時間點采用重復測量方差分析。Kaplan-Meier法繪制各組小鼠實驗期間生存曲線，各組間生存率比較采用Log-rank法。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般情況觀察 小鼠腹腔注射AOM后第3天，開始出現(xiàn)慵懶、厭食、大便增多、稀便情況，注射第9天癥狀表現(xiàn)至高峰。第1次DSS誘導后第2天，小鼠表現(xiàn)為懶動、厭食和出現(xiàn)稀便，1 w后小鼠體質(zhì)量明顯減少，肉眼可見膿血便。4 w后老鼠出現(xiàn)死亡。AS-miR-19a組結(jié)腸灌注AS-miR-19a慢病毒第5天，癥狀明顯緩解。正常對照組小鼠飲食、活動正常，反應機敏，毛發(fā)有光澤，無大便增多和稀便、便血等情況。至實驗第11周處死前，正常對照組無小鼠死亡，AS-miR-19a組小鼠死亡1只，模型組死亡4只，陰性對照組死亡3只，模型組和陰性對照組存活率明顯低于正常對照組和AS-miR-19a組(Log rank=4.764,7.228,3.357,4.832，均P<0.05)。第4周開始，正常對照組小鼠體重明顯高于AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組；第8周開始，AS-miR-19a組小鼠體重明顯高于模型組和陰性對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 UCRCC小鼠體重的變化(g)

與正常對照組比較：1)P<0.05，與AS-miR-19a組比較:2)P<0.05；下表同

2.2miR-19a對AOM/DSS誘導小鼠結(jié)腸炎癥的影響 正常對照組小鼠組織切片可見細胞核大，且分裂相對多，未見組織壞死和炎癥區(qū)域；模型組和陰性對照組可見大量壞死區(qū)域，炎性浸潤嚴重；AS-miR-19a組炎性反應較模型組和陰性對照組明顯減輕，見圖2。

2.3miR-19a對AOM/DSS誘導小鼠結(jié)腸長度、成瘤數(shù)量的影響 與正常對照組比較，模型組和陰性對照組miR-19a表達明顯增加，AS-miR-19a組miR-19a表達顯著降低(均P<0.05)。AS-miR-19a組小鼠結(jié)腸成瘤數(shù)量明顯低于模型組和陰性對照組(均P<0.05)。AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組小鼠結(jié)腸長度較正常對照組明顯縮短，AS-miR-19a組結(jié)腸長度明顯長于模型組和陰性對照組(均P<0.05)，見表2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×100)

2.4免疫組織化學染色檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達 結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin蛋白均為染色為棕褐色，E-cadherin在AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組表達信號強度明顯低于正常對照組，AS-miR-19a組表達信號強度明顯高于模型組和陰性對照組。N-cadherin在AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組表達信號強度明顯高于正常對照組，AS-miR-19a組表達信號強度明顯低于模型組和陰性對照組，見圖3。

2.5Western印跡檢測 與正常對照組比較，AS-miR-19a組，模型組和陰性對照組E-cadherin蛋白表達明顯降低，N-cadherin蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與AS-miR-19a組比較，模型組和陰性對照組E-cadherin蛋白表達顯著降低，N-cadherin蛋白表達顯著升高(均P<0.05)，見表3。

表2 miR-19a對UCRCC小鼠成瘤個數(shù)、 結(jié)腸長度的影響

圖3 免疫組織化學染色檢測小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(×100)

表3 各組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、 N-cadherin蛋白表達

3 討 論

UC與結(jié)直腸癌的癌前狀態(tài)密切相關〔10〕。由于UC發(fā)展至UCRCC是一個稽延事件，這亦為早期防治結(jié)直腸癌提供了機會。正常組織從癌前狀態(tài)發(fā)展為惡性腫瘤是一個多基因調(diào)控過程，多數(shù)腫瘤細胞不具有轉(zhuǎn)移能力，但EMT導致細胞骨架重構(gòu)和破壞細胞間粘連，使上皮細胞表現(xiàn)轉(zhuǎn)化為間葉細胞表型，進而誘導腫瘤的原位侵襲和轉(zhuǎn)移形成新病灶〔11〕。目前在UCRCC中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了EMT現(xiàn)象，EMT理論也很好地解釋了UC作為結(jié)直腸癌危險因素和癌前病變的原因。AOM/DSS誘導UCRCC模型小鼠結(jié)腸組織TNF-α、Snail表達明顯下調(diào)，并且結(jié)腸組織間質(zhì)表型標志物表達水平與炎癥因子正相關〔12〕。TNF-α可促進人結(jié)腸癌HCT116細胞E-cadherin表達減少和N-cadherin表達增加，誘導細胞EMT過程，并介導結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔13〕。 miR-19a是近年來發(fā)現(xiàn)的致癌性miRNA，在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達增加，并且與腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移和浸潤侵襲密切相關〔14〕。生物信息學分析顯示，miR-19a與腫瘤壞死因子(TNF)-α的3′UTR區(qū)域有匹配性，證實了miR-19a對TNF-α的調(diào)控作用〔15〕。陳淑蘭等〔16〕報道稱miR-19a高表達與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和細胞對5-氟尿嘧啶耐藥有關。本研究提示miR-19a可能與UC和UCRCC發(fā)生有關。本研究結(jié)果說明抑制miR-19a表達阻斷UC的非可控性炎癥反應，這對進一步阻斷“炎性→癌變”奠定了病理學基礎。周鵬志等〔17〕證實DSS誘導的UC模型小鼠miR-19a表達增加，中藥白頭翁可能通過調(diào)節(jié)miR-19a表達，發(fā)揮緩解炎癥反應、改善UC病情的作用。本研究結(jié)果提示抑制miR-19a表達可以阻斷UC向UCRCC的發(fā)展，這為結(jié)腸癌的早期防治提供了一個非常有價值的作用靶點。 miRNA是EMT重要的調(diào)控因子，不同miRNAs在EMT中起的作用也不一樣。如miRNA-200家族成員可以下調(diào)間質(zhì)標志物和上調(diào)上皮標志物表達，抑制EMT發(fā)生〔18〕。miR-155則通過抑制E-cadherin表達，破壞細胞間的粘連，促進細胞遷移，誘發(fā)EMT〔19〕。本研究結(jié)果說明AOM/DSS誘導EMT小鼠模型發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，這與Findlay等〔20〕報道結(jié)論一致。利用miR-19a反義寡核苷酸下調(diào)小鼠結(jié)腸組織miR-19a表達，小鼠E-cadherin表達增加，N-cadherin表達相應減少，提示下調(diào)miR-19a表達可能通過阻斷EMT過程抑制UCRCC的發(fā)生。本研究只是初步驗證了miR-19a可能是通過EMT調(diào)控UCRCC的發(fā)生，其具體作用機制還需要深入研究。